Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար:Դուք օգտագործում եք զննարկչի տարբերակ՝ CSS-ի սահմանափակ աջակցությամբ:Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել Համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում):Բացի այդ, շարունակական աջակցություն ապահովելու համար մենք կայքը ցուցադրում ենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Սլայդերներ, որոնք ցույց են տալիս երեք հոդված յուրաքանչյուր սլայդում:Օգտագործեք հետևի և հաջորդ կոճակները՝ սլայդների միջով շարժվելու համար, կամ սլայդ կարգավորիչի կոճակները վերջում՝ յուրաքանչյուր սլայդով շարժվելու համար:

317 Չժանգոտվող պողպատից կծիկ խողովակների մատակարարներ

Չժանգոտվող պողպատից նյութի քիմիական կազմի աղյուսակ

SPACA6-ը սպերմատոզոիդով արտահայտված մակերեսային սպիտակուց է, որը կարևոր նշանակություն ունի կաթնասունների սեռական վերարտադրության ընթացքում գամետների միաձուլման համար:Չնայած այս հիմնարար դերին, SPACA6-ի հատուկ գործառույթը վատ է հասկացվում:Մենք պարզաբանում ենք SPACA6-ի արտաբջջային տիրույթի բյուրեղային կառուցվածքը 2,2 Ա լուծաչափով, բացահայտելով երկտիրույթ սպիտակուց, որը կազմված է չորս շղթայական կապոցից և Ig-ի նմանվող β-սենդվիչներից, որոնք միացված են քվազի ճկուն կապակցիչներով:Այս կառուցվածքը հիշեցնում է IZUMO1-ը՝ մեկ այլ գամետի միաձուլման հետ կապված սպիտակուց, որը կազմում է SPACA6-ը և IZUMO1-ը բեղմնավորման հետ կապված սպիտակուցների գերընտանիքի հիմնադիր անդամներ, որոնք այստեղ նշված են որպես IST գերընտանիք:IST գերընտանիքը կառուցվածքայինորեն սահմանվում է իր ոլորված չորս խխունջ կապոցով և մի զույգ դիսուլֆիդային կապակցված CXXC մոտիվներով:Մարդու պրոտեոմի կառուցվածքի վրա հիմնված AlphaFold որոնումը հայտնաբերել է այս գերընտանիքի լրացուցիչ սպիտակուցային անդամներ.Հատկանշական է, որ այս սպիտակուցներից շատերը ներգրավված են գամետների միաձուլման մեջ:SPACA6 կառուցվածքը և նրա փոխհարաբերությունները IST գերընտանիքի այլ անդամների հետ ապահովում են կաթնասունների գամետների միաձուլման մեր գիտելիքների բացակայող օղակը:
Յուրաքանչյուր մարդու կյանք սկսվում է երկու առանձին հապլոիդ գամետներից՝ հոր սերմնահեղուկից և մոր ձվաբջջից:Այս սերմնահեղուկը հաղթող է ինտենսիվ ընտրության գործընթացում, որի ընթացքում միլիոնավոր սերմնաբջիջներ անցնում են կանանց սեռական տրակտով, հաղթահարում տարբեր խոչընդոտներ1 և ենթարկվում կարողությունների, ինչը մեծացնում է նրանց շարժունակությունը և մակերեսային բաղադրիչների գործընթացը2,3,4:Եթե ​​անգամ սերմնահեղուկն ու ձվաբջիջը գտնեն միմյանց, գործընթացը դեռ ավարտված չէ։Ձվաբջիջը շրջապատված է կուտակված բջիջների շերտով և գլիկոպրոտեինային պատնեշով, որը կոչվում է zona pellucida, որի միջով պետք է անցնի սերմնաբջիջը, որպեսզի մտնի ձվաբջիջ:Սպերմատոզոիդներն օգտագործում են մակերևութային կպչուն մոլեկուլների և թաղանթին առնչվող և արտազատվող ֆերմենտների համադրություն՝ այս վերջնական խոչընդոտները հաղթահարելու համար5:Այս մոլեկուլները և ֆերմենտները հիմնականում պահվում են ներքին թաղանթում և ակրոզոմային մատրիցում և հայտնաբերվում են, երբ սերմի արտաքին թաղանթը լուծվում է ակրոզոմային ռեակցիայի ժամանակ6:Այս ինտենսիվ ճանապարհորդության վերջին քայլը սերմնահեղուկ-ձվի միաձուլման իրադարձությունն է, որի ժամանակ երկու բջիջները միաձուլում են իրենց թաղանթները՝ դառնալով մեկ դիպլոիդ օրգանիզմ7:Չնայած այս գործընթացը բեկումնային է մարդու վերարտադրության մեջ, անհրաժեշտ մոլեկուլային փոխազդեցությունները վատ են հասկացվում:
Բացի գամետների բեղմնավորումից, լայնորեն ուսումնասիրվել է երկու լիպիդային երկշերտների միաձուլման քիմիան։Ընդհանուր առմամբ, մեմբրանի միաձուլումը էներգետիկ առումով անբարենպաստ գործընթաց է, որը պահանջում է սպիտակուցային կատալիզատորի կառուցվածքային կոնֆորմացիայի փոփոխություն, որը մոտեցնում է երկու թաղանթները՝ կոտրելով դրանց շարունակականությունը և առաջացնելով միաձուլում8,9:Այս սպիտակուցային կատալիզատորները հայտնի են որպես ֆուզոգեններ և հայտնաբերվել են անհամար միաձուլման համակարգերում:Դրանք անհրաժեշտ են հյուրընկալող բջիջներ վիրուսի մուտքի համար (օրինակ՝ gp160 ՄԻԱՎ-1-ում, հասկը՝ կորոնավիրուսներում, հեագգլուտինինը գրիպի վիրուսներում) 10,11,12 պլասենցային (սինցիտին)13,14,15 և գամետներ ձևավորող միաձուլումներ ստորին էուկարիոտներում ( HAP2/GCS1 բույսերում, պրոտիստներում և հոդվածոտանիներում) 16,17,18,19.Մարդու գամետների ֆուզոգենները դեռևս պետք է հայտնաբերվեն, թեև մի քանի սպիտակուցներ ապացուցված են, որ կարևոր նշանակություն ունեն գամետների կցման և միաձուլման համար:Ձվաբջիջներով արտահայտված CD9-ը, որը տրանսմեմբրանային սպիտակուց է, որն անհրաժեշտ է մկան և մարդու գամետների միաձուլման համար, առաջինն էր, որը հայտնաբերվեց 21,22,23:Թեև դրա ճշգրիտ գործառույթը մնում է անհասկանալի, դերը կպչման մեջ, ձվի միկրովիլիների վրա կպչող օջախների կառուցվածքը և/կամ ձվաբջիջի մակերեսային սպիտակուցների ճիշտ տեղայնացումը հավանական է թվում 24,25,26:Երկու ամենատիպիկ սպիտակուցները, որոնք կարևոր են գամետների միաձուլման համար, սերմնաբջիջների IZUMO127 և ձվաբջիջների JUNO28 սպիտակուցներն են, և նրանց փոխադարձ կապը կարևոր քայլ է գամետների ճանաչման և միաձուլման համար:Արու Izumo1 նոկաուտ մկները և էգ Juno նոկաուտ մկները լիովին ստերիլ են, այս մոդելներում սերմնահեղուկը մտնում է պերիվիտելի տարածություն, բայց գամետները չեն միաձուլվում:Նմանապես, միախառնումը կրճատվել է, երբ գամետները բուժվել են հակա-IZUMO1 կամ JUNO27,29 հակամարմիններով մարդկանց արտամարմնային բեղմնավորման փորձերում:
Վերջերս հայտնաբերվել է սպերմատոզոիդով արտահայտված սպիտակուցների նորահայտ խումբ, որը ֆենոտիպիկ կերպով նման է IZUMO1-ին և JUNO-ին 20,30,31,32,33,34,35:Սերմի ակրոզոմային մեմբրանի հետ կապված սպիտակուց 6 (SPACA6) հայտնաբերվել է որպես բեղմնավորման համար անհրաժեշտ մկների մուտագենեզի լայնածավալ ուսումնասիրության ժամանակ:Տրանսգենի ներդրումը Spaca6 գենի մեջ առաջացնում է չձուլվող սպերմատոզոիդներ, թեև այդ սպերմատոզոիդները ներթափանցում են պերիվիտելի տարածություն 36:Հետագա նոկաուտ հետազոտությունները մկների վրա հաստատեցին, որ Spaca6-ն անհրաժեշտ է գամետների միաձուլման համար 30,32:SPACA6-ն արտահայտվում է գրեթե բացառապես ամորձիներում և ունի տեղայնացման օրինաչափություն, որը նման է IZUMO1-ին, մասնավորապես՝ սերմնաբջիջների ինտիմայի ներսում մինչև ակրոզոմային ռեակցիան, այնուհետև գաղթում է դեպի հասարակածային շրջան ակրոզոմային ռեակցիայից հետո 30,32:Spaca6 հոմոլոգները գոյություն ունեն մի շարք կաթնասունների և այլ էուկարիոտների մեջ 30 և դրա կարևորությունը մարդու գամետների միաձուլման համար ապացուցվել է մարդու բեղմնավորման արգելակմամբ SPACA6 30-ի նկատմամբ դիմադրությամբ:Ի տարբերություն IZUMO1-ի և JUNO-ի, SPACA6-ի կառուցվածքի, փոխազդեցությունների և գործառույթի մանրամասները մնում են անհասկանալի:
Մարդկային սերմնահեղուկի և ձվաբջիջների միաձուլման հիմքում ընկած հիմնարար գործընթացը ավելի լավ հասկանալու համար, որը մեզ հնարավորություն կտա տեղեկացնել ընտանիքի պլանավորման և պտղաբերության բուժման հետագա զարգացումները, մենք իրականացրել ենք SPACA6 կառուցվածքային և կենսաքիմիական հետազոտություններ:SPACA6-ի արտաբջջային տիրույթի բյուրեղային կառուցվածքը ցույց է տալիս չորս պարուրաձև կապոց (4HB) և իմունոգլոբուլինանման (Ig-ի նման) տիրույթ, որոնք կապված են քվազիճկուն շրջաններով:Ինչպես կանխատեսվել էր նախորդ ուսումնասիրություններում, 7,32,37 SPACA6-ի տիրույթի կառուցվածքը նման է մարդու IZUMO1-ի կառուցվածքին, և երկու սպիտակուցները կիսում են անսովոր մոտիվը.Մենք առաջարկում ենք, որ IZUMO1-ը և SPACA6-ն այժմ սահմանեն սպիտակուցների ավելի մեծ, կառուցվածքային առնչվող գերընտանիք՝ կապված գամետների միաձուլման հետ:Օգտագործելով գերընտանիքին եզակի առանձնահատկությունները, մենք կատարեցինք AlphaFold կառուցվածքային մարդկային պրոտեոմի սպառիչ որոնում՝ բացահայտելով այս գերընտանիքի լրացուցիչ անդամներ, ներառյալ մի քանի անդամներ, որոնք ներգրավված են գամետների միաձուլման և/կամ բեղմնավորման մեջ:Այժմ թվում է, որ գոյություն ունի գամետների միաձուլման հետ կապված սպիտակուցների ընդհանուր կառուցվածքային ծալք և գերընտանիք, և մեր կառուցվածքը տրամադրում է մարդու գամետների միաձուլման մեխանիզմի այս կարևոր ասպեկտի մոլեկուլային քարտեզը:
SPACA6-ը մեկ անցումով տրանսմեմբրանային սպիտակուց է՝ մեկ N-կապակցված գլիկանով և վեց ենթադրյալ դիսուլֆիդային կապերով (Նկարներ S1a և S2):Մենք արտահայտեցինք մարդու SPACA6-ի արտաբջջային տիրույթը (մնացորդներ 27–246) Drosophila S2 բջիջներում և մաքրեցինք սպիտակուցը՝ օգտագործելով նիկելի մերձեցումը, կատիոնների փոխանակումը և չափի բացառման քրոմատագրությունը (նկ. S1b):Մաքրված SPACA6 էկտոդոմինը շատ կայուն է և միատարր:Չափերի բացառման քրոմատոգրաֆիայի միջոցով զուգորդված լույսի բազմանկյուն ցրման (SEC-MALS) կիրառմամբ հայտնաբերված 26,2 ± 0,5 կԴա հաշվարկված մոլեկուլային քաշով մեկ գագաթ (նկ. S1c):Սա համահունչ է SPACA6 մոնոմեր էկտոդոմենի չափին, ինչը ցույց է տալիս, որ օլիգոմերացում չի եղել մաքրման ընթացքում:Բացի այդ, շրջանաձև երկխոսության (CD) սպեկտրոսկոպիան հայտնաբերել է խառը α/β կառուցվածք՝ 51,3 °C հալման կետով (նկ. S1d,e):CD սպեկտրների ապակոնվոլյուցիան բացահայտեց 38,6% α-պտուտակաձև և 15,8% β-շղթա ունեցող տարրեր (Նկար S1d):
SPACA6 էկտոդոմինը բյուրեղացվել է պատահական մատրիցային սերմնավորման միջոցով38, որի արդյունքում ստացվել է 2,2 Å թույլատրելիությամբ տվյալների հավաքածու (Աղյուսակ 1 և Նկար S3):Օգտագործելով բեկորների վրա հիմնված մոլեկուլային փոխարինման և SAD փուլային տվյալների համակցությունը բրոմի ազդեցության հետ կառուցվածքի որոշման համար (Աղյուսակ 1 և Գծապատկեր S4), վերջնական մշակված մոդելը բաղկացած է 27–246 մնացորդներից:Կառուցվածքի որոշման ժամանակ չկար փորձարարական կամ AlphaFold կառուցվածքներ:SPACA6 էկտոդոմինը չափում է 20 Å × 20 Å × 85 Å, բաղկացած է յոթ պարույրներից և ինը β-շղթայից և ունի երկարացված երրորդական ծալք, որը կայունացել է վեց դիսուլֆիդային կապերով (նկ. 1a, b):Asn243 կողային շղթայի վերջում թույլ էլեկտրոնային խտությունը ցույց է տալիս, որ այս մնացորդը N-կապակցված գլիկոզիլացում է:Կառուցվածքը բաղկացած է երկու տիրույթից՝ N-տերմինալ չորս պարուրաձև կապոց (4HB) և C-տերմինալ Ig-անման տիրույթ՝ նրանց միջև ընկած միջանկյալ հանգույցով (նկ. 1c):
SPACA6-ի արտաբջջային տիրույթի կառուցվածքը:SPACA6-ի արտաբջջային տիրույթի շերտային դիագրամ, շղթայի գույնը N-ից մինչև C-վերջնակետ՝ մուգ կապույտից մինչև մուգ կարմիր:Ցիստեինները, որոնք ներգրավված են դիսուլֆիդային կապերում, ընդգծված են մանուշակագույնով:բ SPACA6-ի արտաբջջային տիրույթի տոպոլոգիա.Օգտագործեք նույն գունային սխեման, ինչպես նկար 1ա-ում:գ SPACA6 արտաբջջային տիրույթ.4HB-ի, կրունկի և Ig-ի նման տիրույթի ժապավենային գծապատկերները համապատասխանաբար գունավորված են նարնջագույն, կանաչ և կապույտ:Շերտերը մասշտաբով չեն գծվում:
SPACA6-ի 4HB տիրույթը ներառում է չորս հիմնական պարուրակներ (1–4 պարույրներ), որոնք դասավորված են պարուրաձև պարուրաձևի տեսքով (նկ. 2ա)՝ փոխարինելով հակազուգահեռ և զուգահեռ փոխազդեցությունների միջև (նկ. 2բ):Փոքր լրացուցիչ մեկ պտույտով պարույրը (պարույր 1′) դրված է կապոցին ուղղահայաց՝ ձևավորելով եռանկյունի 1 և 2 պարույրներով։ Նկար 2ա):
4HB N-տերմինալ շերտի աղյուսակ.b Չորս պարույրներից բաղկացած փաթեթի վերևի տեսքը, որոնցից յուրաքանչյուրը ընդգծված է մուգ կապույտով N-վերնամասում և մուգ կարմիրով` C-վերջում:c Վերևից ներքև պարուրաձև անիվի դիագրամ 4HB-ի համար, յուրաքանչյուր մնացորդով ցուցադրված է որպես շրջանակ, որը պիտակավորված է մեկ տառով ամինաթթուների կոդով.միայն անիվի վերևում գտնվող չորս ամինաթթուները համարակալված են:Ոչ բևեռային մնացորդները գունավորվում են դեղին, բևեռային չլիցքավորված մնացորդները՝ կանաչ, դրական լիցքավորված մնացորդները՝ կապույտ, իսկ բացասական լիցքավորված մնացորդները՝ կարմիր:d 4HB տիրույթի եռանկյուն դեմքեր՝ 4HB նարնջագույնով և ծխնիներով՝ կանաչ:Երկու ներդիրներն էլ ցույց են տալիս ձողաձև դիսուլֆիդային կապեր։
4HB-ը կենտրոնացած է ներքին հիդրոֆոբ միջուկի վրա, որը կազմված է հիմնականում ալիֆատիկ և արոմատիկ մնացորդներից (նկ. 2c):Միջուկը պարունակում է դիսուլֆիդային կապ Cys41-ի և Cys55-ի միջև, որը կապում է 1-ին և 2-րդ պարույրները վերին բարձրացված եռանկյունու մեջ (նկ. 2d):Երկու լրացուցիչ դիսուլֆիդային կապեր են ձևավորվել CXXC մոտիվների միջև Helix 1′-ում և մեկ այլ CXXC մոտիվի միջև, որը հայտնաբերվել է ծխնի հատվածում β-սանրվածքի ծայրին (նկ. 2d):Անհայտ ֆունկցիայով պահպանողական արգինինի մնացորդը (Arg37) գտնվում է 1′, 1 և 2 պարույրներով ձևավորված խոռոչ եռանկյունու ներսում: Ածխածնի ալիֆատիկ ատոմները Cβ, Cγ և Cδ Arg37 փոխազդում են հիդրոֆոբ միջուկի հետ, և նրա գուանիդինային խմբերը ցիկլային կերպով շարժվում են: 1' և ​​1 պարույրների միջև Thr32 ողնաշարի և կողային շղթայի փոխազդեցության միջոցով (նկ. S5a,b):Tyr34-ը տարածվում է խոռոչի մեջ՝ թողնելով երկու փոքր խոռոչներ, որոնց միջոցով Arg37-ը կարող է փոխազդել լուծիչի հետ:
Ig-ի նման β-սենդվիչ տիրույթները սպիտակուցների մեծ գերընտանիք են, որոնք ունեն երկու կամ ավելի բազմաշղթա ամֆիպաթիկ β-թերթի ընդհանուր հատկանիշը, որոնք փոխազդում են հիդրոֆոբ միջուկի միջոցով 39: SPACA6-ի C-տերմինալ Ig-անման տիրույթն ունի նույն օրինաչափությունը: եւ բաղկացած է երկու շերտից (նկ. S6a)։Թերթ 1-ը չորս թելերից բաղկացած β-թերթ է (շողեր D, F, H և I), որտեղ F, H և I շղթաները կազմում են հակազուգահեռ դասավորություն, իսկ I և D շղթաները զուգահեռ փոխազդեցություն են ստանում:Աղյուսակ 2-ը փոքր հակազուգահեռ երկշղթա բետա թերթ է (շողեր E և G):Դիտվել է ներքին դիսուլֆիդային կապ E շղթայի C-վերնամասի և H շղթայի կենտրոնի (Cys170-Cys226) միջև (նկ. S6b):Այս դիսուլֆիդային կապը նման է իմունոգլոբուլինի β-սենդվիչ տիրույթի դիսուլֆիդային կապին40,41:
Չորս շղթա ունեցող β-թերթիկը պտտվում է իր ողջ երկարությամբ՝ ձևավորելով ասիմետրիկ եզրեր, որոնք տարբերվում են ձևով և էլեկտրաստատիկությամբ:Ավելի բարակ եզրը հարթ հիդրոֆոբ միջավայր է, որն առանձնանում է SPACA6-ում մնացած անհարթ և էլեկտրաստատիկորեն տարբեր մակերեսների համեմատությամբ (նկ. S6b,c):Հիդրոֆոբ մակերեսը շրջապատում է բաց ողնաշարի կարբոնիլ/ամինո խմբերի և բևեռային կողային շղթաների հալո (նկ. S6c):Ավելի լայն լուսանցքը ծածկված է կափարիչով պարուրաձև հատվածով, որը արգելափակում է հիդրոֆոբ միջուկի N-տերմինալ մասը և կազմում է երեք ջրածնային կապ F շղթայի ողնաշարի բաց բևեռային խմբի հետ (նկ. S6d):Այս եզրի C-տերմինալ մասը կազմում է մեծ գրպան՝ մասամբ բաց հիդրոֆոբ միջուկով:Գրպանը շրջապատված է դրական լիցքերով արգինինի կրկնակի մնացորդների երեք խմբերի (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 և Arg212-Arg214) և կենտրոնական հիստիդինի (His220) շնորհիվ (Նկար S6e):
Ծխնի շրջանը կարճ հատված է պարուրաձև տիրույթի և Ig-անման տիրույթի միջև, որը բաղկացած է մեկ հակազուգահեռ եռաշերտ β-շերտից (շերտեր A, B և C), փոքր 310 պարույր և մի քանի երկար պատահական պարուրաձև հատվածներ։(նկ. S7):Կովալենտային և էլեկտրաստատիկ կոնտակտների ցանցը կախվածքի շրջանում, կարծես, կայունացնում է կողմնորոշումը 4HB-ի և Ig-ի նման տիրույթի միջև:Ցանցը կարելի է բաժանել երեք մասի.Առաջին մասը ներառում է երկու CXXC մոտիվներ (27CXXC30 և 139CXXC142), որոնք ձևավորում են զույգ դիսուլֆիդային կապեր ծխնիի β-մազակալի և 4HB-ում 1' պարույրի միջև:Երկրորդ մասը ներառում է էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությունները Ig նման տիրույթի և ծխնիի միջև:Glu132-ը ծխնիի մեջ կազմում է աղի կամուրջ Arg233-ով Ig-ի նման տիրույթում և Arg135-ով ծխնիում:Երրորդ մասը ներառում է կովալենտային կապ Ig նման տիրույթի և կրունկի շրջանի միջև:Երկու դիսուլֆիդային կապեր (Cys124-Cys147 և Cys128-Cys153) կապում են կրունկի հանգույցը մի կապիչի հետ, որը կայունանում է Gln131-ի և ողնաշարի ֆունկցիոնալ խմբի միջև էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությունների միջոցով, ինչը թույլ է տալիս մուտք գործել Ig-անման առաջին տիրույթ:շղթա.
SPACA6 էկտոդոմենի կառուցվածքը և 4HB և Ig նման տիրույթների առանձին կառուցվածքները օգտագործվել են սպիտակուցային տվյալների բազաներում կառուցվածքային նման գրառումներ փնտրելու համար 42:Մենք հայտնաբերեցինք համընկնումներ՝ Dali Z-ի բարձր միավորներով, փոքր ստանդարտ շեղումներով և մեծ LALI միավորներով (վերջինս կառուցվածքով համարժեք մնացորդների քանակն է):Մինչդեռ էկտոդոմենի ամբողջական որոնումից առաջին 10 հարվածները (Աղյուսակ S1) ունեին ընդունելի Z- միավոր >842, միայն 4HB կամ Ig-ի նման տիրույթի որոնումը ցույց տվեց, որ այդ հիթերից շատերը համապատասխանում են միայն β-սենդվիչներին:շատ սպիտակուցներում հայտնաբերված ամենուր տարածված ծալք:Դալիում բոլոր երեք որոնումները տվեցին միայն մեկ արդյունք՝ IZUMO1:
Երկար ժամանակ ենթադրվում էր, որ SPACA6-ը և IZUMO1-ը կառուցվածքային նմանություններ ունեն7,32,37:Չնայած այս երկու գամետների միաձուլման հետ կապված սպիտակուցների էկտոդոմինները կիսում են միայն 21% հաջորդականության նույնականացումը (Նկար S8a), բարդ ապացույցները, ներառյալ պահպանված դիսուլֆիդային կապի ձևը և կանխատեսված C-տերմինալ Ig-ի նման տիրույթը SPACA6-ում, թույլ տվեցին վաղ փորձեր կառուցել A և SPACA6 մկնիկի հոմոլոգիայի մոդելը, օգտագործելով IZUMO1-ը որպես ձևանմուշ37:Մեր կառուցվածքը հաստատում է այս կանխատեսումները և ցույց է տալիս նմանության իրական աստիճանը։Իրականում, SPACA6 և IZUMO137,43,44 կառուցվածքները կիսում են նույն երկու տիրույթի ճարտարապետությունը (նկ. S8b) նմանատիպ 4HB և Ig-ի նման β-սենդվիչ տիրույթների հետ, որոնք կապված են կախովի շրջանով (նկ. S8c):
IZUMO1-ը և SPACA6 4HB-ն ունեն ընդհանուր տարբերություններ սովորական պարուրաձև կապոցներից:Տիպիկ 4HB-ները, ինչպես հայտնաբերվածները SNARE սպիտակուցային կոմպլեքսներում, որոնք ներգրավված են էնդոսոմային միաձուլման մեջ 45,46, ունեն հավասարաչափ տարածված խխունջներ, որոնք պահպանում են մշտական ​​կորությունը կենտրոնական առանցքի շուրջ 47: Ի հակադրություն, պարուրաձև տիրույթները և՛ IZUMO1-ում, և՛ SPACA6-ում աղավաղված են՝ փոփոխական կորությամբ և անհավասար փաթեթավորում (Նկար S8d):Պտտումը, որը հավանաբար առաջացել է 1′, 1 և 2 պարույրներով ձևավորված եռանկյունու պատճառով, պահպանվում է IZUMO1-ում և SPACA6-ում և կայունանում է նույն CXXC-ի մոտիվով պարույր 1′-ի վրա:Այնուամենայնիվ, SPACA6-ում հայտնաբերված լրացուցիչ դիսուլֆիդային կապը (Cys41 և Cys55 կովալենտորեն կապող 1 և 2 պարույրները վերևում) ստեղծում է ավելի սուր գագաթ եռանկյան գագաթում՝ դարձնելով SPACA6-ն ավելի ոլորված, քան IZUMO1-ը՝ ավելի ընդգծված խոռոչի եռանկյուններով:Բացի այդ, IZUMO1-ում բացակայում է Arg37-ը, որը դիտվել է այս խոռոչի կենտրոնում SPACA6-ում:Ի հակադրություն, IZUMO1-ն ունի ալիֆատիկ և անուշաբույր մնացորդների ավելի բնորոշ հիդրոֆոբ միջուկ:
IZUMO1-ն ունի Ig-անման տիրույթ, որը բաղկացած է երկշղթա և հնգաշղթա β-թերթից43:IZUMO1-ի լրացուցիչ շարանը փոխարինում է SPACA6-ի կծիկը, որը փոխազդում է F շղթայի հետ՝ սահմանափակելով ողնաշարի ջրածնային կապերը շղթայում:Համեմատության հետաքրքիր կետը երկու սպիտակուցների Ig նման տիրույթների կանխատեսված մակերևութային լիցքն է:IZUMO1 մակերեսը ավելի բացասական լիցքավորված է, քան SPACA6 մակերեսը:Լրացուցիչ լիցքավորումը տեղադրված է սերմնահեղուկի դեմ ուղղված C-տերմինալի մոտ:SPACA6-ում նույն շրջաններն ավելի չեզոք էին կամ դրական լիցքավորված (նկ. S8e):Օրինակ, SPACA6-ում հիդրոֆոբ մակերեսը (ավելի բարակ եզրեր) և դրական լիցքավորված փոսերը (ավելի լայն եզրեր) բացասական լիցքավորված են IZUMO1-ում:
Թեև IZUMO1-ի և SPACA6-ի միջև փոխհարաբերությունները և երկրորդական կառուցվածքի տարրերը լավ պահպանված են, Ig-ի նման տիրույթների կառուցվածքային հավասարեցումը ցույց տվեց, որ երկու տիրույթները տարբերվում են իրենց ընդհանուր ուղղվածությամբ միմյանց նկատմամբ (նկ. S9):IZUMO1-ի պարուրաձև կապոցը կորացած է β-սենդվիչի շուրջ՝ ստեղծելով նախկինում նկարագրված «բումերանգի» ձևը կենտրոնական առանցքից մոտ 50° հեռավորության վրա:Ի հակադրություն, SPACA6-ում պարուրաձև ճառագայթը թեքվել է մոտ 10° հակառակ ուղղությամբ:Այս կողմնորոշումների տարբերությունները, ամենայն հավանականությամբ, պայմանավորված են կրունկի շրջանի տարբերություններով:Առաջնային հաջորդականության մակարդակում IZUMO1-ը և SPACA6-ը կիսում են փոքր հաջորդականության նմանությունը կախվածքի վրա, բացառությամբ ցիստեինի, գլիցինի և ասպարաթթվի մնացորդների:Արդյունքում ջրածնային կապերն ու էլեկտրաստատիկ ցանցերը բոլորովին տարբեր են։β-թերթի երկրորդական կառուցվածքի տարրերը կիսում են IZUMO1-ը և SPACA6-ը, չնայած IZUMO1-ի շղթաները շատ ավելի երկար են, և 310 պարույրը (պարույր 5) եզակի է SPACA6-ի համար:Այս տարբերությունները հանգեցնում են տիրույթի տարբեր կողմնորոշումների երկու այլապես նման սպիտակուցների համար:
Մեր Dali սերվերի որոնումը ցույց տվեց, որ SPACA6-ը և IZUMO1-ը սպիտակուցների տվյալների բազայում պահպանված փորձարարորեն որոշված ​​միակ երկու կառույցներն են, որոնք ունեն այս կոնկրետ 4HB ծալքը (Աղյուսակ S1):Վերջերս DeepMind-ը (Alphabet/Google) մշակել է AlphaFold-ը՝ նեյրոնային ցանցի վրա հիմնված համակարգ, որը կարող է ճշգրիտ կանխատեսել սպիտակուցների 3D կառուցվածքները առաջնային հաջորդականություններից48:SPACA6 կառուցվածքը լուծելուց անմիջապես հետո թողարկվեց AlphaFold տվյալների բազան՝ տրամադրելով կանխատեսող կառուցվածքի մոդելներ, որոնք ընդգրկում էին մարդու պրոտեոմի բոլոր սպիտակուցների 98,5%-ը48,49:Օգտագործելով մեր լուծված SPACA6 կառուցվածքը որպես որոնման մոդել, AlphaFold մարդկային պրոտեոմի մոդելի կառուցվածքային հոմոլոգիայի որոնումը հայտնաբերել է SPACA6-ի և IZUMO1-ի հետ հնարավոր կառուցվածքային նմանություններ ունեցող թեկնածուների:Հաշվի առնելով AlphaFold-ի անհավանական ճշգրտությունը SPACA6-ը (նկ. S10a) կանխատեսելիս, հատկապես 1,1 Å rms էկտոդոմինը մեր լուծված կառուցվածքի համեմատ (նկ. S10b), մենք կարող ենք վստահ լինել, որ SPACA6-ի հայտնաբերված համընկնումները, հավանաբար, ճշգրիտ են:
Նախկինում PSI-BLAST-ը որոնել է IZUMO1 կլաստերը երեք այլ սերմնաբջիջների հետ կապված սպիտակուցներով՝ IZUMO2, IZUMO3 և IZUMO450:AlphaFold-ը կանխատեսեց, որ այս IZUMO ընտանիքի սպիտակուցները ծալվում են դեպի 4HB տիրույթ՝ նույն դիսուլֆիդային կապի ձևով, ինչպիսին IZUMO1-ն է (Նկարներ 3a և S11), թեև նրանց բացակայում է Ig-ման տիրույթը:Ենթադրվում է, որ IZUMO2-ը և IZUMO3-ը միակողմանի թաղանթային սպիտակուցներ են, որոնք նման են IZUMO1-ին, մինչդեռ IZUMO4-ը կարծես արտազատվում է:IZUMO 2, 3 և 4 սպիտակուցների գործառույթները գամետների միաձուլման մեջ որոշված ​​չեն:Հայտնի է, որ IZUMO3-ը դեր է խաղում ակրոսոմի կենսագենեզում սերմնաբջիջների զարգացման ընթացքում51, իսկ IZUMO սպիտակուցը կազմում է բարդույթ50:Կաթնասունների, սողունների և երկկենցաղների մոտ IZUMO սպիտակուցների պահպանումը ցույց է տալիս, որ նրանց պոտենցիալ գործառույթը համահունչ է այլ հայտնի գամետների միաձուլման հետ կապված սպիտակուցների, ինչպիսիք են DCST1/2, SOF1 և FIMP:
IST գերընտանիքի տիրույթի ճարտարապետության դիագրամ՝ համապատասխանաբար նարնջագույն, կանաչ և կապույտ գույներով ընդգծված 4HB, կրունկ և Ig նման տիրույթներով:IZUMO4-ն ունի եզակի C-տերմինալ շրջան, որը սև տեսք ունի:Հաստատված և ենթադրյալ դիսուլֆիդային կապերը ցուցադրվում են համապատասխանաբար պինդ և կետավոր գծերով:b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1) և DB՝ AF-Q1ZYL8-F1)՝ AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) ցուցադրվում են նույն գունային տիրույթում, ինչ Ա վահանակը: Դիսուլֆիդային կապերը ցուցադրվում են մանուշակագույնով:TMEM95, IZUMO2 և IZUMO3 տրանսմեմբրանային պարույրները ցուցադրված չեն:
Ի տարբերություն IZUMO սպիտակուցի, մյուս SPACA սպիտակուցները (այսինքն՝ SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 և SPACA9) ենթադրվում է, որ կառուցվածքով տարբերվում են SPACA6-ից (նկ. S12):Միայն SPACA9-ն ունի 4HB, բայց չի ակնկալվում, որ այն կունենա նույն զուգահեռ հակազուգահեռ կողմնորոշումը կամ նույն դիսուլֆիդային կապը, ինչ SPACA6-ը:Միայն SPACA1-ն ունի նմանատիպ Ig տիրույթ:AlphaFold-ը կանխատեսում է, որ SPACA3-ը, SPACA4-ը և SPACA5-ն ունեն բոլորովին այլ կառուցվածք, քան SPACA6-ը:Հետաքրքիր է, որ SPACA4-ը նույնպես հայտնի է, որ դեր է խաղում բեղմնավորման մեջ, բայց ավելի մեծ չափով, քան SPACA6-ը, փոխարենը հեշտացնում է սերմնահեղուկի և oocyte zona pellucida-ի փոխազդեցությունը52:
Մեր AlphaFold որոնումը գտավ ևս մեկ համընկնում IZUMO1 և SPACA6 4HB, TMEM95 համար:TMEM95-ը՝ սերմնահեղուկին հատուկ տրանսմեմբրանային սպիտակուց, արու մկներին դարձնում է անպտղություն, երբ ջարդվում է 32,33:TMEM95-ից զուրկ սպերմատոզոիդներն ունեին նորմալ մորֆոլոգիա, շարժունակություն և կարողություն ներթափանցել pellucida գոտի և կապվել ձվի թաղանթին, բայց չէին կարող միաձուլվել ձվաբջիջի թաղանթին:Նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ TMEM95-ը կառուցվածքային նմանություններ ունի IZUMO133-ի հետ:Իրոք, AlphaFold մոդելը հաստատեց, որ TMEM95-ը 4HB է նույն զույգ CXXC մոտիվներով, ինչպես IZUMO1-ը և SPACA6-ը և նույն լրացուցիչ դիսուլֆիդային կապը 1-ին և 2-րդ պարույրների միջև, որոնք հայտնաբերված են SPACA6-ում (նկ. 3a և S11):Չնայած TMEM95-ին բացակայում է Ig-ի նման տիրույթը, այն ունի դիսուլֆիդային կապի ձևով շրջան, որը նման է SPACA6 և IZUMO1 կախովի շրջաններին (նկ. 3b):Այս ձեռագրի հրապարակման պահին նախատպման սերվերը հաղորդում է TMEM95-ի կառուցվածքը՝ հաստատելով AlphaFold53 արդյունքը:TMEM95-ը շատ նման է SPACA6-ին և IZUMO1-ին և էվոլյուցիոն առումով պահպանված է արդեն երկկենցաղներում (նկ. 4 և S13):
PSI-BLAST որոնումն օգտագործել է NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP և SOF1 տվյալների բազաները՝ որոշելու այս հաջորդականությունների դիրքը կյանքի ծառում:Ճյուղային կետերի միջև հեռավորությունները չեն ցուցադրվում մասշտաբով:
SPACA6-ի և IZUMO1-ի ընդհանուր կառուցվածքային ապշեցուցիչ նմանությունը ցույց է տալիս, որ նրանք պահպանված կառուցվածքային գերընտանիքի հիմնադիր անդամներ են, որը ներառում է TMEM95 և IZUMO 2, 3 և 4 սպիտակուցները:հայտնի անդամներ՝ IZUMO1, SPACA6 և TMEM95:Քանի որ միայն մի քանի անդամներ ունեն Ig նման տիրույթներ, IST գերընտանիքի նշանը 4HB տիրույթն է, որն ունի եզակի առանձնահատկություններ, որոնք ընդհանուր են այս բոլոր սպիտակուցների համար. 5ա), 2) կապոցն ունի եռանկյուն երես, որը բաղկացած է երկու պարույրներից և երրորդ ուղղահայաց պարույրից (նկ. առանցքային տարածք (նկ. 5c): Հայտնի է, որ CXXC մոտիվը, որը հայտնաբերված է թիորեդոքսինանման սպիտակուցներում, գործում է: որպես ռեդոքս սենսոր 54,55,56, մինչդեռ IST ընտանիքի անդամների մոտիվը կարող է կապված լինել սպիտակուցային դիսուլֆիդային իզոմերազների հետ, ինչպիսին է ERp57-ը գամետների միաձուլման մեջ:Դերը կապված են 57,58:
IST գերընտանիքի անդամները սահմանվում են 4HB տիրույթի երեք բնորոշ հատկանիշներով՝ չորս պարույրներ, որոնք փոխվում են զուգահեռ և հակազուգահեռ կողմնորոշման միջև, ba-եռանկյունաձև պարուրաձև կապոցային դեմքեր և փոքր մոլեկուլների միջև ձևավորված ca CXXC կրկնակի մոտիվ:) N-տերմինալ խխունջներ (նարնջագույն) և կրունկի շրջան β-սանրվածք (կանաչ):
Հաշվի առնելով SPACA6-ի և IZUMO1-ի նմանությունը, փորձարկվել է առաջինի` IZUMO1-ին կամ JUNO-ին կապվելու ունակությունը:Կենսաշերտերի ինտերֆերոմետրիան (BLI) կինետիկ վրա հիմնված կապող մեթոդ է, որը նախկինում օգտագործվել է IZUMO1-ի և JUNO-ի փոխազդեցությունը քանակականացնելու համար:Բիոտինով պիտակավորված սենսորի ինկուբացիայից հետո IZUMO1-ով որպես JUNO անալիտի բարձր կոնցենտրացիայով խայծ, հայտնաբերվեց ուժեղ ազդանշան (նկ. S14a), որը ցույց է տալիս սենսորային ծայրին կցված կենսանյութի հաստության կապակցման հետևանքով փոփոխություն:Նմանատիպ ազդանշաններ (այսինքն՝ JUNO-ն միացված է սենսորին որպես խայծ IZUMO1 անալիտի դեմ) (նկ. S14b):Ոչ մի ազդանշան չի հայտնաբերվել, երբ SPACA6-ը որպես անալիտ օգտագործվում է սենսորային կապակցված IZUMO1-ի կամ սենսորով կապված JUNO-ի դեմ (Նկար S14a,b):Այս ազդանշանի բացակայությունը ցույց է տալիս, որ SPACA6-ի արտաբջջային տիրույթը չի փոխազդում IZUMO1-ի կամ JUNO-ի արտաբջջային տիրույթի հետ:
Քանի որ BLI վերլուծությունը հիմնված է խայծի սպիտակուցի վրա ազատ լիզինի մնացորդների բիոտինիլացման վրա, այս փոփոխությունը կարող է կանխել կապը, եթե լիզինի մնացորդները ներգրավված են փոխազդեցության մեջ:Բացի այդ, սենսորի նկատմամբ կապակցման կողմնորոշումը կարող է ստեղծել ստերիկ խոչընդոտներ, ուստի սովորական քաշվող վերլուծություններ են կատարվել նաև ռեկոմբինանտ SPACA6, IZUMO1 և JUNO էկտոդոմեյնների վրա:Չնայած դրան, SPACA6-ը չի առաջացել His-tagged IZUMO1-ի կամ His-tagged JUNO-ի հետ (նկ. S14c,d), ինչը ցույց չի տալիս, որ որևէ փոխազդեցություն չի համապատասխանում BLI-ի փորձարկումներին:Որպես դրական վերահսկողություն, մենք հաստատեցինք JUNO-ի փոխազդեցությունը պիտակավորված His IZUMO1-ի հետ (Նկարներ S14e և S15):
Չնայած SPACA6-ի և IZUMO1-ի կառուցվածքային նմանությանը, SPACA6-ի JUNO-ին կապելու անկարողությունը զարմանալի չէ:Մարդկային IZUMO1-ի մակերեսը ունի ավելի քան 20 մնացորդ, որոնք փոխազդում են JUNO-ի հետ, ներառյալ մնացորդները երեք շրջաններից յուրաքանչյուրից (չնայած դրանց մեծ մասը գտնվում է ծխնի շրջանում) (նկ. S14f):Այս մնացորդներից միայն մեկը պահպանված է SPACA6-ում (Glu70):Թեև մնացորդային շատ փոխարինումներ պահպանեցին իրենց սկզբնական կենսաքիմիական հատկությունները, IZUMO1-ում էական Arg160 մնացորդը փոխարինվեց SPACA6-ում բացասական լիցքավորված Asp148-ով;Նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ Arg160Glu մուտացիան IZUMO1-ում գրեթե ամբողջությամբ վերացնում է JUNO43-ի հետ կապը:Բացի այդ, IZUMO1-ի և SPACA6-ի միջև տիրույթի կողմնորոշման տարբերությունը զգալիորեն մեծացրել է SPACA6-ի վրա համարժեք շրջանի JUNO-կապող տեղամասի մակերեսը (նկ. S14g):
Չնայած գամետների միաձուլման համար SPACA6-ի հայտնի անհրաժեշտությանը և IZUMO1-ի նմանությանը, SPACA6-ը կարծես թե չունի JUNO-ի համարժեք կապող ֆունկցիա:Հետևաբար, մենք ձգտել ենք համատեղել մեր կառուցվածքային տվյալները էվոլյուցիոն կենսաբանության կողմից տրված կարևորության ապացույցների հետ:SPACA6 հոմոլոգների հաջորդականությունը ցույց է տալիս ընդհանուր կառուցվածքի պահպանումը կաթնասուններից դուրս:Օրինակ, ցիստեինի մնացորդները առկա են նույնիսկ հեռավոր ազգակից երկկենցաղներում (նկ. 6ա):Օգտագործելով ConSurf սերվերը, SPACA6 մակերեսին քարտեզագրվեցին 66 հաջորդականությունների բազմակի հաջորդականության հավասարեցման տվյալները:Այս տեսակի վերլուծությունը կարող է ցույց տալ, թե որ մնացորդներն են պահպանվել սպիտակուցի էվոլյուցիայի ընթացքում և կարող է ցույց տալ, թե մակերևութային որ շրջանները դեր են խաղում ֆունկցիայի մեջ:
12 տարբեր տեսակների SPACA6 էկտոդոմեյնների հաջորդականության հավասարեցում, պատրաստված CLUSTAL OMEGA-ի միջոցով:ConSurf-ի վերլուծության համաձայն՝ կապույտով նշված են ամենապահպանողական դիրքերը։Ցիստեինի մնացորդները ընդգծված են կարմիրով:Տիրույթի սահմանները և երկրորդական կառուցվածքի տարրերը ցուցադրված են հարթության վերևում, որտեղ սլաքները ցույց են տալիս β-շղթաները, իսկ ալիքները՝ պարույրները:Հերթականությունները պարունակող NCBI Access Identifiers-ն են՝ մարդ (Homo sapiens, NP_001303901), մանդրիլ (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), կապուչին կապիկ (Cebus mimic, XP_017359360), XP_017359360, XP_017359360), XP_017359360, XP_017359360, XP_017359360, XP_017359360, XP_017359360, XP_017359360, XP_017359360, XP_017359360, 201303901, 201303901, Orcinus orca3_23 XP_032_034) .), ոչխար (Ovis aries, XP_014955560), փիղ (Loxodonta africana, XP_010585293), շուն (Canis lupus familyis, XP_025277208), մուկ (Mus musculus, NP_001156manianph381), մուկ (Mus musculus, NP_001156manianph101), , XP_0318), Platypus, 8) , 61_89 և Ցուլֆրոգ (Bufo bufo, XP_040282113):Համարակալումը հիմնված է մարդկային կարգի վրա:b SPACA6 կառուցվածքի մակերևութային ներկայացում 4HB-ով վերևում և Ig-ի նման տիրույթով ներքևում, գույներ՝ հիմնված ConSurf սերվերի պահպանման գնահատումների վրա:Լավագույն պահպանված մասերը կապույտն են, չափավոր պահպանվածները՝ սպիտակ, ամենաքիչ պահպանվածները՝ դեղին։մանուշակագույն ցիստեին:Պաշտպանության բարձր մակարդակ ցուցադրող մակերևույթի երեք պատյաններ ցուցադրված են ներդիրների 1, 2 և 3 պիտակներով: 4HB մուլտֆիլմը ցուցադրված է վերևի աջ մասում (նույն գունային սխեման):
SPACA6 կառուցվածքը ունի երեք խիստ պահպանված մակերեսային շրջաններ (նկ. 6b):Patch 1-ն ընդգրկում է 4HB և ծխնի շրջանը և պարունակում է երկու պահպանված CXXC դիսուլֆիդային կամուրջներ, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 կախովի ցանց (Նկար S7) և երեք պահպանված արտաքին արոմատիկ մնացորդներ (Phe31, Tyr73, Phe137):Ig-ի նման տիրույթի ավելի լայն եզր (նկ. S6e), որը ներկայացնում է մի քանի դրական լիցքավորված մնացորդներ սերմի մակերեսի վրա:Հետաքրքիր է, որ այս կարկատակը պարունակում է հակամարմինների էպիտոպ, որը նախկինում ապացուցվել է, որ խանգարում է SPACA6 30 ֆունկցիային:Տարածաշրջան 3-ն ընդգրկում է Ig նման տիրույթի կրունկը և մի կողմը;այս շրջանը պարունակում է պահպանված պրոլիններ (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) և դեպի դուրս ուղղված բևեռային/լիցքավորված մնացորդներ:Զարմանալիորեն, 4HB-ի մակերևույթի մնացորդների մեծ մասը խիստ փոփոխական է (նկ. 6b), չնայած ծալքը պահպանված է SPACA6 հոմոլոգի ողջ տարածքում (ինչպես ցույց է տալիս հիդրոֆոբ փաթեթի միջուկի պահպանողականությունը) և IST գերընտանիքի սահմաններից դուրս:
Թեև սա SPACA6-ի ամենափոքր շրջանն է՝ ամենաքիչ նկատելի երկրորդական կառուցվածքի տարրերով, շատ կախովի շրջանի մնացորդներ (ներառյալ 3-րդ շրջանը) խիստ պահպանված են SPACA6 հոմոլոգների մեջ, ինչը կարող է ցույց տալ, որ պարուրաձև փաթեթի և β-սենդվիչի կողմնորոշումը դեր է խաղում:որպես պահպանողական.Այնուամենայնիվ, չնայած SPACA6-ի և IZUMO1-ի ծխնի շրջանում առկա ջրածնային կապերի և էլեկտրաստատիկ ցանցերի առկայությանը, ներքին ճկունության ապացույցը կարելի է տեսնել IZUMO137,43,44-ի բազմակի թույլատրելի կառույցների դասավորվածության մեջ:Առանձին տիրույթների դասավորվածությունը լավ համընկնում էր, բայց տիրույթների կողմնորոշումը միմյանց նկատմամբ տատանվում էր կենտրոնական առանցքից 50°-ից մինչև 70° (նկ. S16):SPACA6-ի կոնֆորմացիոն դինամիկան լուծույթում հասկանալու համար կատարվել են SAXS փորձեր (նկ. S17a,b):SPACA6 էկտոդոմինի սկզբնական շրջանում վերակառուցումը համապատասխանում էր ձողային բյուրեղային կառուցվածքին (Նկար S18), թեև Կրատկի սյուժեն ցույց տվեց ճկունության որոշակի աստիճան (նկ. S17b):Այս կոնֆորմացիան հակադրվում է IZUMO1-ի հետ, որտեղ չկապված սպիտակուցը բումերանգի ձև է ընդունում ինչպես ցանցում, այնպես էլ լուծույթում43:
Ճկուն շրջանը հատուկ բացահայտելու համար ջրածնի-դեյտերիումի փոխանակման զանգվածային սպեկտրոսկոպիա (H-DXMS) իրականացվեց SPACA6-ի վրա և համեմատվեց IZUMO143-ի վրա նախկինում ստացված տվյալների հետ (նկ. 7a,b):SPACA6-ն ակնհայտորեն ավելի ճկուն է, քան IZUMO1-ը, ինչը ցույց է տալիս 100,000 վրկ փոխանակումից հետո ամբողջ կառուցվածքում դեյտերիումի ավելի բարձր փոխանակում:Երկու կառույցներում էլ կրունկի շրջանի C-տերմինալ մասը ցույց է տալիս փոխանակման բարձր մակարդակ, ինչը, հավանաբար, թույլ է տալիս 4HB և Ig նման տիրույթների սահմանափակ ռոտացիա միմյանց նկատմամբ:Հետաքրքիր է, որ SPACA6 ծխնի C-տերմինալ մասը, որը բաղկացած է 147CDLPLDCP154 մնացորդից, խիստ պահպանված տարածք է 3 (նկ. 6b), ինչը, հնարավոր է, ցույց է տալիս, որ միջդոմենային ճկունությունը SPACA6-ի էվոլյուցիոնորեն պահպանված հատկանիշն է:Ըստ ճկունության վերլուծության, CD-ի ջերմային հալոցքի տվյալները ցույց են տվել, որ SPACA6-ը (Tm = 51,2°C) ավելի քիչ կայուն է, քան IZUMO1-ը (Tm = 62,9°C) (նկ. S1e և S19):
a SPACA6-ի և b IZUMO1-ի H-DXMS պատկերները:Դեյտերիումի տոկոսային փոխանակումը որոշվել է նշված ժամանակային կետերում:Ջրածին-դեյտերիումի փոխանակման մակարդակները նշվում են գույնով կապույտից (10%) մինչև կարմիր (90%) գրադիենտ սանդղակով:Սև արկղերը ներկայացնում են բարձր փոխանակման տարածքներ:Բյուրեղային կառուցվածքում նկատված 4HB, կրունկի և Ig-ի նման տիրույթի սահմանները ցուցադրված են առաջնային հաջորդականության վերևում:Դեյտերիումի փոխանակման մակարդակները 10 վրկ, 1000 վ և 100,000 վրկ գծագրվել են SPACA6-ի և IZUMO1-ի թափանցիկ մոլեկուլային մակերեսների վրա դրված ժապավենային գծապատկերի վրա:50%-ից ցածր դեյտերիումի փոխանակման մակարդակ ունեցող կառույցների մասերը գունավոր են սպիտակ:H-DXMS փոխանակման 50%-ից բարձր տարածքները գունավորվում են գրադիենտ մասշտաբով:
CRISPR/Cas9-ի և մկան գենի նոկաուտի գենետիկական ռազմավարությունների օգտագործումը հանգեցրել է մի քանի գործոնների բացահայտմանը, որոնք կարևոր են սերմնահեղուկի և ձվաբջիջների միացման և միաձուլման համար:Բացի IZUMO1-JUNO-ի և CD9 կառուցվածքի լավ բնութագրված փոխազդեցությունից, գամետների միաձուլման հետ կապված սպիտակուցների մեծ մասը կառուցվածքային և ֆունկցիոնալ առումով մնում է հանելուկային:SPACA6-ի կենսաֆիզիկական և կառուցվածքային բնութագրումը բեղմնավորման ընթացքում կպչուն/միաձուլման մոլեկուլային գլուխկոտրուկի ևս մեկ մասն է:
SPACA6-ը և IST գերընտանիքի մյուս անդամները, ըստ երևույթին, խիստ պահպանված են կաթնասունների, ինչպես նաև առանձին թռչունների, սողունների և երկկենցաղների մեջ.Իրականում, ենթադրվում է, որ SPACA6-ը նույնիսկ անհրաժեշտ է զեբրաձկան 59-ի բեղմնավորման համար: Այս բաշխումը նման է գամետների միաձուլման հետ կապված այլ հայտնի սպիտակուցներին, ինչպիսիք են DCST134, DCST234, FIMP31 և SOF132, ինչը ենթադրում է, որ այս գործոնները HAP2-ի պակաս ունեն (նաև հայտնի է որպես GCS1) սպիտակուցներ, որոնք պատասխանատու են բազմաթիվ պրոտիստների կատալիտիկ գործունեության համար:, բույսեր և հոդվածոտանիներ։Բեղմնավորված միաձուլման սպիտակուցներ 60, 61: Չնայած SPACA6-ի և IZUMO1-ի կառուցվածքային ուժեղ նմանությանը, այս սպիտակուցներից որևէ մեկը կոդավորող գեների նոկաուտը հանգեցրեց արու մկների անպտղության, ինչը ցույց է տալիս, որ գամետների միաձուլման մեջ նրանց գործառույթները կրկնօրինակված չեն:.Ավելի լայնորեն, սերմի հայտնի սպիտակուցներից և ոչ մեկը, որը պահանջվում է միաձուլման կպչուն փուլի համար, ավելորդ չէ:
Մնում է բաց հարց՝ արդյոք SPACA6-ը (և IST գերընտանիքի մյուս անդամները) մասնակցում են միջգամետական ​​հանգույցներին, ձևավորում են ներգամետիկ ցանցեր՝ միաձուլման կետերում կարևոր սպիտակուցներ հավաքագրելու համար, կամ գուցե նույնիսկ գործում են որպես խուսափողական միաձուլիչներ:HEK293T բջիջներում համատեղ իմունային նստվածքների ուսումնասիրությունները բացահայտեցին փոխազդեցություն ամբողջ երկարությամբ IZUMO1-ի և SPACA632-ի միջև:Այնուամենայնիվ, մեր ռեկոմբինանտ էկտոդոմեյնները չեն փոխազդում in vitro, ինչը ենթադրում է, որ փոխազդեցությունները դիտվում են Noda et al.երկուսն էլ ջնջվել են կոնստրուկտում (նկատի ունեցեք IZUMO1-ի ցիտոպլազմիկ պոչը, որն անհարկի է բեղմնավորման համար62):Որպես այլընտրանք, IZUMO1-ը և/կամ SPACA6-ը կարող են պահանջել հատուկ կապող միջավայրեր, որոնք մենք չենք վերարտադրում in vitro, օրինակ՝ ֆիզիոլոգիապես հատուկ կոնֆորմացիաներ կամ այլ սպիտակուցներ պարունակող մոլեկուլային բարդույթներ (հայտնի կամ դեռ չհայտնաբերված):Թեև ենթադրվում է, որ IZUMO1 էկտոդոմինը միջնորդում է սերմնաբջիջների կցումը ձվին պերիվիտելի տարածության մեջ, SPACA6 էկտոդոմենի նպատակը պարզ չէ:
SPACA6-ի կառուցվածքը բացահայտում է մի քանի պահպանված մակերեսներ, որոնք կարող են ներգրավված լինել սպիտակուցի և սպիտակուցի փոխազդեցության մեջ:Ծխնի շրջանի պահպանված հատվածը անմիջապես կից CXXC մոտիվին (վերևում նշված է Patch 1-ը) ունի մի քանի արտաքին ուղղված անուշաբույր մնացորդներ, որոնք հաճախ կապված են բիոմոլեկուլների միջև հիդրոֆոբ և π-շարժվող փոխազդեցությունների հետ:Ig-ի նման տիրույթի լայն կողմերը (տարածաշրջան 2) ստեղծում են դրական լիցքավորված ակոս՝ բարձր պահպանված Arg-ի և նրա մնացորդներով, և այս շրջանի դեմ հակամարմինները նախկինում օգտագործվել են գամետների միաձուլումը արգելափակելու համար 30:Հակամարմինը ճանաչում է 212RIRPAQLTHRGTFS225 գծային էպիտոպը, որն ունի արգինինի վեց մնացորդներից երեքը և խիստ պահպանված His220:Պարզ չէ՝ դիսֆունկցիան պայմանավորված է այս կոնկրետ մնացորդների արգելափակմամբ, թե ամբողջ տարածաշրջանով:Այս բացվածքի գտնվելու վայրը β-սենդվիչի C-տերմինալի մոտ ցույց է տալիս cis-փոխազդեցությունը հարևան սերմնաբջիջների սպիտակուցների հետ, բայց ոչ ձվաբջիջների սպիտակուցների հետ:Ավելին, կախվածքի ներսում բարձր ճկուն պրոլինով հարուստ խճճվածքի պահպանումը (կայք 3) կարող է լինել սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցության վայր կամ, ավելի հավանական է, ցույց տալ ճկունության պահպանումը երկու տիրույթների միջև:Սեռը կարևոր է SPACA6-ի անհայտ դերի համար:գամետների միաձուլում.
SPACA6-ն ունի միջբջջային կպչուն սպիտակուցների հատկություններ, ներառյալ Ig-ի նմանվող β-սենդվիչներ:Շատ կպչուն սպիտակուցներ (օրինակ՝ կադերիններ, ինտեգրիններ, ադհեզիններ և IZUMO1) ունեն մեկ կամ մի քանի β-սենդվիչ տիրույթներ, որոնք տարածում են սպիտակուցները բջջային թաղանթից մինչև իրենց շրջակա միջավայրի թիրախները63,64,65:SPACA6-ի Ig-անման տիրույթը նաև պարունակում է մի մոտիվ, որը սովորաբար հանդիպում է կպչունության և միաձուլման β-սենդվիչներում՝ β-սենդվիչների ծայրերում զուգահեռ թելերի կրկնապատկերներ, որոնք հայտնի են որպես մեխանիկական սեղմիչներ66:Ենթադրվում է, որ այս մոտիվը մեծացնում է դիմադրությունը կտրող ուժերին, ինչը արժեքավոր է միջբջջային փոխազդեցության մեջ ներգրավված սպիտակուցների համար։Այնուամենայնիվ, չնայած ադհեզինների նմանությանը, ներկայումս որևէ ապացույց չկա, որ SPACA6-ը փոխազդում է ձվի սպիտակուցի հետ:SPACA6 էկտոդոմինը չի կարողանում կապվել JUNO-ի հետ, և SPACA6-արտահայտող HEK293T բջիջները, ինչպես ցույց է տրված այստեղ, հազիվ թե փոխազդեն այն ձվաբջիջների հետ, որոնք չունեն գոտի 32:Եթե ​​SPACA6-ը հաստատում է միջգամետիկ կապեր, այդ փոխազդեցությունները կարող են պահանջել հետթարգմանական փոփոխություններ կամ կայունացում այլ սերմնաբջիջների սպիտակուցների կողմից:Ի պաշտպանություն վերջին վարկածի, IZUMO1-ի պակաս ունեցող սերմնաբջիջները կապվում են ձվաբջիջների հետ՝ ցույց տալով, որ IZUMO1-ից բացի այլ մոլեկուլներ ներգրավված են գամետների կպչման քայլ 27-ում:
Բազմաթիվ վիրուսային, բջջային և զարգացման միաձուլման սպիտակուցներ ունեն հատկություններ, որոնք կանխատեսում են նրանց գործառույթը որպես ֆուզոգեն:Օրինակ, վիրուսային միաձուլման գլիկոպրոտեինները (I, II և III դասեր) ունեն հիդրոֆոբ միաձուլման պեպտիդ կամ հանգույց սպիտակուցի վերջում, որը տեղադրված է հյուրընկալող թաղանթում:IZUMO143-ի հիդրոֆիլության քարտեզը և IST գերընտանիքի կառուցվածքը (որոշված ​​և կանխատեսված) ցույց չեն տվել ակնհայտ հիդրոֆոբ միաձուլման պեպտիդ:Այսպիսով, եթե IST գերընտանիքում որևէ սպիտակուց գործում է որպես ֆուզոգեն, նրանք դա անում են այլ հայտնի օրինակներից տարբերվող ձևով:
Եզրափակելով, սպիտակուցների IST գերընտանիքի անդամների գործառույթները, որոնք կապված են գամետների միաձուլման հետ, մնում են գայթակղիչ առեղծված:Մեր բնութագրված SPACA6 ռեկոմբինանտ մոլեկուլը և դրա լուծված կառուցվածքը հնարավորություն կտան պատկերացում կազմել այս ընդհանուր կառուցվածքների միջև փոխհարաբերությունների և նրանց դերի մասին գամետների միացման և միաձուլման մեջ:
ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը, որը համապատասխանում է կանխատեսված մարդու SPACA6 էկտոդոմային (NCBI մուտքի համարը NP_001303901.1; մնացորդներ 27–246) կոդոնով օպտիմիզացվել է Drosophila melanogaster S2 բջիջներում արտահայտվելու համար և սինթեզվել է որպես գենի դրվագ՝ GenicsEurofin կոդավորման հաջորդականությամբ:, BiP սեկրեցիայի ազդանշանը և համապատասխան 5' և 3' ծայրերը այս գենի կապակցումից անկախ կլոնավորման համար pMT արտահայտման վեկտորի մեջ, որը հիմնված է պուրոմիցինի (pMT-puro) ընտրության համար փոփոխված մետալոտիոնեին պրոմոտորի վրա:pMT-puro վեկտորը կոդավորում է թրոմբինի ճեղքման վայրը, որին հաջորդում է 10x-His C-տերմինալ պիտակը (Նկար S2):
SPACA6 pMT-puro վեկտորի կայուն տրանսֆեկցիան D. melanogaster S2 (Gibco) բջիջներում իրականացվել է IZUMO1-ի և JUNO43-ի համար օգտագործվող արձանագրության նման:S2 բջիջները հալվեցին և աճեցվեցին Շնայդերի միջավայրում (Gibco), որը համալրված էր 10% (v/v) ջերմությամբ անակտիվացված պտղի հորթի շիճուկով (Gibco) և 1X հակամիկոտիկ հակաբիոտիկով (Gibco):Վաղ անցուղու բջիջները (3,0 x 106 բջիջներ) տեղադրվել են 6 հորատանցքի ափսեների առանձին հորերում (Կորնինգ):27°C-ում 24 ժամ ինկուբացիայից հետո բջիջները փոխակերպվել են 2 մգ SPACA6 pMT-puro վեկտորի և Effectene տրանսֆեկցիոն ռեագենտի (Qiagen) խառնուրդով՝ ըստ արտադրողի արձանագրության:Տրանսֆեկցիոն բջիջները ինկուբացվել են 72 ժամ, այնուհետև հավաքվել 6 մգ/մլ պուրոմիցինով:Բջիջներն այնուհետև մեկուսացվեցին Շնայդերի ամբողջական միջավայրից և տեղադրվեցին շիճուկից զերծ Insect-XPRESS միջավայրում (Lonza)՝ լայնածավալ սպիտակուցի արտադրության համար:S2 բջիջների կուլտուրայի 1 լ խմբաքանակը աճեցվեց մինչև 8-10 × 106 մլ-1 բջիջներ 2 լ օդափոխվող հարթ հատակով պոլիպրոպիլենային Էրլենմայերի կոլբայի մեջ, այնուհետև մանրէազերծվեց 500 μM CuSO4 (Milipore Sigma) վերջնական կոնցենտրացիայով և ստերիլ զտվեց:դրդված.Առաջացած կուլտուրաները ինկուբացվել են 27°C ջերմաստիճանում 120 պտույտ/րոպեում չորս օր:
SPACA6 պարունակող պայմանական միջավայրը մեկուսացվել է ցենտրիֆուգմամբ 5660×g 4°C-ում, որին հաջորդում է Centramate շոշափող հոսքի ֆիլտրման համակարգ (Pall Corp) 10 կԴա MWCO թաղանթով:Կիրառեք SPACA6 պարունակող խտացված միջավայր 2 մլ Ni-NTA ագարոզային խեժի (Qiagen) սյունակում:Ni-NTA խեժը լվացվել է 10 սյունակի ծավալներով (CV) բուֆեր A-ով, այնուհետև ավելացվել է 1 CV բուֆեր A՝ ստանալով իմիդազոլի վերջնական կոնցենտրացիան 50 մՄ:SPACA6-ը մաքրվել է 10 մլ բուֆեր A-ով, որը լրացվել է իմիդազոլով մինչև 500 մՄ վերջնական կոնցենտրացիան:Սահմանափակման դասի թրոմբին (Millipore Sigma) ավելացվել է անմիջապես դիալիզի խողովակին (MWCO 12-14 կԴա) 1 միավոր SPACA6 մգ-ով ընդդեմ 1 լ 10 մՄ տրիս-HCl, pH 7,5 և 150 մՄ NaCl (բուֆեր B) դիալիզի համար:) 4°C ջերմաստիճանում 48 ժամ:Թրոմբինով ճեղքված SPACA6-ը այնուհետև եռակի նոսրացվեց՝ նվազեցնելու աղի կոնցենտրացիան և բեռնվեց 1 մլ MonoS 5/50 GL կատիոնափոխանակման սյունակի վրա (Cytiva/GE)՝ հավասարակշռված 10 մՄ Tris-HCl, pH 7,5:Կատիոնափոխանակիչը լվացվեց 3 OK 10 mM Tris-HCl-ով, pH 7.5, այնուհետև SPACA6-ը զտվեց 0-ից 500 մմ NaCl գծային գրադիենտով 10 մմ Tris-HCl-ում, pH 7.5 25 OK-ի համար:Իոնափոխանակման քրոմատոգրաֆիայից հետո SPACA6-ը խտացվել է մինչև 1 մլ և իզոկրատական ​​եղանակով զտվել ENrich SEC650 10 x 300 սյունակից (BioRad)՝ հավասարակշռված բուֆեր B-ով:Մաքրությունը վերահսկվում էր Coomassie-ով ներկված էլեկտրոֆորեզով 16% SDS-պոլիակրիլամիդ գելի վրա:Սպիտակուցի կոնցենտրացիան քանակականացվել է կլանման միջոցով 280 նմ-ում՝ օգտագործելով Beer-Lambert օրենքը և մոլային մարման տեսական գործակիցը:
Մաքրված SPACA6-ը գիշերվա ընթացքում դիալիզացվել է 10 մՄ նատրիումի ֆոսֆատի, pH 7,4 և 150 մՄ NaF-ի դեմ և նոսրացվել է մինչև 0,16 մգ/մլ մինչև CD սպեկտրոսկոպիայի միջոցով վերլուծությունը:185-ից 260 նմ ալիքի երկարությամբ CD-ների սպեկտրային սկանավորումը հավաքվել է Jasco J-1500 սպեկտրոպոլիմետրի վրա՝ օգտագործելով 1 մմ օպտիկական ուղու երկարությամբ (Helma) քվարցային կուվետներ 25°C-ում 50 նմ/րոպե արագությամբ:CD սպեկտրները շտկվել են ելակետային գծում, միջինացվել են ավելի քան 10 ձեռքբերում և վերածվել միջին մնացորդային էլիպտիկության (θMRE)՝ սմ2/դմոլ աստիճաններով.
որտեղ ՄՎտ-ը յուրաքանչյուր նմուշի մոլեկուլային քաշն է Da-ում;N-ը ամինաթթուների թիվն է.θ-ն էլիպսականությունն է միլիաստիճաններով;d-ը համապատասխանում է օպտիկական ուղու երկարությանը սմ-ով;սպիտակուցի կոնցենտրացիան միավորներով: