Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար:Դուք օգտագործում եք զննարկչի տարբերակ՝ CSS-ի սահմանափակ աջակցությամբ:Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել Համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում):Բացի այդ, շարունակական աջակցություն ապահովելու համար մենք կայքը ցուցադրում ենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Սլայդերներ, որոնք ցույց են տալիս երեք հոդված յուրաքանչյուր սլայդում:Օգտագործեք հետևի և հաջորդ կոճակները՝ սլայդների միջով շարժվելու համար, կամ սլայդ կարգավորիչի կոճակները վերջում՝ յուրաքանչյուր սլայդով շարժվելու համար:
Հստակեցում
310 10*1 մմ Չժանգոտվող պողպատից փաթաթված խողովակների մատակարարներ
| Դասարան | 301 ,304 ,304L ,316 ,316L ,309 S,310 ,321 |
| Ստանդարտ | ASTM A240, JIS G4304, G4305, GB/T 4237, GB/T 8165, BS 1449, DIN17460, DIN 17441 |
| Հաստությունը | 0,2-10,0մմ |
| Լայնությունը | 600 մմ րոպե |
| Երկարություն | 2000 մմ-8000 մմ կամ հաճախորդների խնդրանքով |
| Մակերեւույթի ավարտ | NO1,No.4,2B, BA, 6K, 8K, Մազերի գիծ PVC-ով |
Քիմիական բաղադրությունը
| Դասարան | C | Si | Mn | P≤ | S≤ | Cr | Mo | Ni | Այլ |
| 301 թ | ≤0,15 | ≤1.00 | ≤2.00 | 0,045 | 0.03 | 16-18 թթ | - | 6.0 | - |
| 304 | ≤0,07 | ≤1.00 | ≤2.00 | 0,035 | 0.03 | 17-19 թթ | - | 8.0 | - |
| 304 լ | ≤0,075 | ≤1.00 | ≤2.00 | 0,045 | 0.03 | 17-19 թթ | - | 8.0 | |
| 309Ս | ≤0.08 | ≤1.00 | ≤2.00 | 0,045 | 0.03 | 22-24 | - | 12.0 | - |
| 310 թ | ≤0.08 | ≤1,5 | ≤2.00 | 0,045 | 0.03 | 24-26 | - | 19.0 | - |
| 316 | ≤0.08 | ≤1.00 | ≤2.00 | 0,045 | 0.03 | 16-18.5 | 2 | 10.0 | - |
| 316 լ | ≤0.03 | ≤1.00 | ≤2.00 | 0,045 | 0.03 | 16-18 թթ | 2 | 10.0 | - |
| 321 թ | ≤0.12 | ≤1.00 | ≤2.00 | 0,045 | 0.03 | 17-19 թթ | - | 9.0 | Ti≥5×C |
Մեխանիկական հատկություններ
| Դասարան | YS(Mpa) ≥ | TS (Mpa) ≥ | Էլ (%) ≥ | Կարծրություն (HV) ≤ |
| 301 թ | 200 թ | 520 թ | 40 | 180 թ |
| 304 | 200 թ | 520 թ | 50 | 165-175 թթ |
| 304 լ | 175 | 480 թ | 50 | 180 թ |
| 309Ս | 200 թ | 520 թ | 40 | 180 թ |
| 310 թ | 200 թ | 520 թ | 40 | 180 թ |
| 316 | 200 թ | 520 թ | 50 | 180 թ |
| 316 լ | 200 թ | 480 թ | 50 | 180 թ |
| 321 թ | 200 թ | 520 թ | 40 | 180 թ |
Սարդի մետաքսի ռեկոմբինանտ սպիտակուցները (սարդի մետաքսի սպիտակուցները) բազմաթիվ պոտենցիալ կիրառություններ ունեն նոր կենսանյութերի մշակման մեջ, սակայն դրանց բազմամոդալ և ագրեգացիոն բնույթը դժվարացնում է դրանք ձեռք բերելը և հեշտ օգտագործելը:Այստեղ մենք հայտնում ենք, որ ռեկոմբինանտ մանրանկարչություն spidroin սպիտակուցները և, որ կարևոր է, N-տերմինալ տիրույթը (NT) ինքնին արագորեն ձևավորում են ինքնակառավարվող և թափանցիկ հիդրոգելներ 37 °C ջերմաստիճանում:միաձուլման սպիտակուցները, որոնք բաղկացած են NT-ից և կանաչ լյումինեսցենտային սպիտակուցից կամ պուրինային նուկլեոզիդ ֆոսֆորիլազից, ձևավորում են լիովին ֆունկցիոնալ միաձուլման սպիտակուցներ:Հիդրոգելներ.Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ ռեկոմբինանտ NT և միաձուլված սպիտակուցները ապահովում են արտահայտման բարձր ելք և հիդրոգելներին օժտում գրավիչ հատկություններով, ինչպիսիք են թափանցիկությունը, ժելացումը առանց խաչաձև կապի և ակտիվ սպիտակուցների ուղղակի անշարժացում բարձր խտության դեպքում:
Սարդերն ունեն մինչև յոթ տարբեր մետաքսի խցուկներ, որոնցից յուրաքանչյուրն արտադրում է որոշակի տեսակի մետաքս:Մետաքսի բոլոր յոթ տեսակները կազմված են սարդի մետաքսի սպիտակուցներից (սպիդրոիններ) մոտավորապես 6000 մնացորդներով և պարունակում են մեծ կենտրոնական կրկնվող շրջան՝ շրջապատված գնդաձև N- և C-տերմինալ տիրույթներով (NT և CT)1,2:Մետաքսի ամենաշատ ուսումնասիրված տեսակը՝ առաջնային ամպուլան, արտադրվում է առաջնային ամպուլային գեղձի կողմից։Այս գեղձում էպիթելային բջիջների միաշերտը սինթեզում է սպիդրոինի սպիտակուցները և արտազատում դրանք գեղձի լույսի մեջ, որտեղ դրանք առկա են լուծվող ձևով (դոպինգ) չափազանց բարձր կոնցենտրացիաներում (30–50% w/v)3,4։Քննարկվել է գեղձի հիմնական ամպուլյար սպիդրոինի սպիտակուցների կազմակերպումն ու կազմաձևումը, սակայն փորձարարական ապացույցների մեծ մասը ցույց է տալիս ընդհանուր պարուրաձև և/կամ պատահական պարուրաձև կոնֆորմացիայի և միցելային կամ շերտավոր կառուցվածքների առկայությունը5,6,7,8,9,10:Մինչ կրկնվող տիրույթները կարգավորում են մետաքսե մանրաթելերի մեխանիկական հատկությունները՝ ձևավորելով β-թերթային նանոբյուրեղներ և ամորֆ կառուցվածքներ11,12,13,14,15, վերջի տիրույթները կարգավորում են մետաքսե մանրաթելերը՝ ի պատասխան մետաքսի գեղձի երկայնքով փոփոխվող պայմանների16,17,18:Մետաքսի ձևավորումը վերահսկելով՝ 19. Տերմինալային տիրույթները պահպանվում են էվոլյուցիոն ճանապարհով, և դրանց գործառույթը կարող է ընդհանուր լինել բոլոր սպիդրոին սպիտակուցների համար 2,20,21:Գեղձի միջով անցնելու ժամանակ սպիդրոինի pH-ը նվազում է մոտավորապես 7,6-ից մինչև < 5,716 և աճում է կտրվածքով և ձգվելով, որը միջնորդվում է աստիճանաբար նեղացող ծորանով շարժման միջոցով:Լուծման մեջ CT-ը α-պտուտակաձև կազմող զուգահեռ դիմեր17 է, բայց ի պատասխան ցածր pH-ի և ճեղքման ուժերի, CT-ն բացվում և փոխարկում է β-շերտերը16, 17, հնարավոր է առաջացնել β-շերտեր Convert 16-ի կրկնվող շրջաններում: NT-ն մոնոմեր է: պայմանները, որոնք արտացոլում են գեղձի լույսի պայմանները և միջնորդում են սպիդրոինի լուծելիությունը, սակայն նվազեցված pH-ի դեպքում մի շարք կարբոքսիլաթթվի կողային շղթաների պրոտոնավորումը հանգեցնում է NT-ի դիմերիզացմանը pKa-ով մոտավորապես 6,5, դրանով իսկ կայունացնելով NT և ամրացնելով սպիդրոյինը մեծ քանակությամբ: քանակները.ցանցեր16,18.Այսպիսով, NT-ն առանցքային դեր է խաղում թելերի ձևավորման մեջ՝ ծածկույթի մոնոմերից վերածվելով մանրաթելում դիմերի23,24,25:NT-ն մնում է խիստ լուծելի և պտուտակաձև բոլոր պայմաններում, որոնք ուսումնասիրվել են մինչ օրս16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, ինչը ոգեշնչեց նրա զարգացումը որպես լուծելիությունը բարձրացնող պիտակ՝ հետերոլոգ սպիտակուցների արտադրության համար:
Մինի սարդի մետաքսի ռեկոմբինանտ սպիտակուցը, որը բաղկացած է մեկ NT-ից, մեկ կարճ կրկնվող շրջանից, մեկ CT-ից և մաքրման համար նախատեսված His6 պիտակից (His-NT2RepCT), նույնքան լուծվում է ջրային բուֆերում, որքան բնիկ սարդի մետաքսի սպիտակուցը և ընդօրինակում է մետաքսի սարդի բնիկ կարևոր բնութագրերը: .ծածկույթ 25.31.His-NT2RepCT-ը կարող է պտտվել շարունակական մանրաթելերի մեջ՝ օգտագործելով բիոմիմետիկ մեքենա, որտեղ pH 8 լուծվող ծածկույթը դուրս է մղվում pH 525,32,33,34,35 ջրային բաղնիքի մեջ:His-NT2RepCT-ն արտահայտող E. coli-ի բիոռեակտորային խմորումը և հետագա հետմշակումը հանգեցրել են մաքրումից հետո >14 գ/լ արդյունքի:Բարձր եկամտաբերությունը, բարձր լուծելիությունը և His-NT2RepCT-ի համարժեք արձագանքը թթվային պայմաններին վերագրվում են NT23, 25, 34:
Այստեղ մենք զեկուցում ենք թափանցիկ հիդրոգելների արագ ձևավորման մասին ռեկոմբինանտ սպիդրոյին սպիտակուցներից, ներառյալ միայն NT, սպիտակուցային լուծույթը ինկուբացնելով 37 °C ջերմաստիճանում:Օգտագործելով թիոֆլավին T ֆլյուորեսցենտը (ThT), Ֆուրիեի փոխակերպման ինֆրակարմիր սպեկտրոսկոպիան (FTIR), միջուկային մագնիսական ռեզոնանսային սպեկտրոսկոպիան (NMR) և փոխանցման էլեկտրոնային մանրադիտակը (TEM), մենք պարզեցինք, որ NT և միկրոսարդի սպիտակուցները կառուցվածքային փոխակերպվում են β-թերթիկների և ամիլոիդային թելերի։ երբ գոյանում են գելեր.Բացի այդ, NT-ի և կանաչ ֆլուորեսցենտային սպիտակուցի (GFP) կամ պուրինի նուկլեոզիդ ֆոսֆորիլազի (PNP) միաձուլման սպիտակուցները ձևավորում են հիդրոգելներ՝ լիովին ֆունկցիոնալ միաձուլման բեկորներով:Բարձր թողունակության արտահայտումը հետերոլոգ հյուրընկալողներում, զուգորդված ֆիզիոլոգիական պայմաններում հիդրոգելների արագ ձևավորման հետ, բացում է ինժեներական գործառույթներով հիդրոգելների ծախսարդյունավետ արտադրության հնարավորությունը:
Ի տարբերություն հաղորդված ռեկոմբինանտ սպիդրոին սպիտակուցների36 մեծամասնության, His-NT2RepCT-ը կայուն է Tris-HCl բուֆերում pH 8-ում և կարող է խտացվել մինչև 500 մգ/մլ առանց տեղումների25:Հետևաբար, մենք զարմացանք, երբ հայտնաբերեցինք, որ այս սպիտակուցը արագորեն ձևավորում է օպտիկականորեն պարզ, ինքնակառավարվող հիդրոգելներ, երբ ինկուբացվում է 37°C-ում (նկ. 1b-d):Հետագա ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ His-NT2RepCT ժելացումը տեղի է ունեցել սպիտակուցի կոնցենտրացիաների լայն շրջանակում (10–300 մգ/մլ) և որ այս կոնցենտրացիան հակադարձ փոխկապակցված է ժելացման ժամանակի հետ (նկ. 1c և լրացուցիչ նկար 1):Պարզելու համար, թե His-NT2RepCT-ի որ մասերն են միջնորդում հիդրոգելի առաջացմանը, մենք այնուհետև ուսումնասիրեցինք յուրաքանչյուր տիրույթ առանձին և տարբեր համակցություններով՝ օգտագործելով կոլբայի ինվերսիայի վերլուծություն (Նկար 1ա, բ):Ռեկոմբինանտ սպիդրոինի բոլոր փորձարկված ֆրակցիաները 1 ժամից պակաս ժամանակահատվածում ձևավորել են գելեր (սպիտակուցի 300 մգ/մլ կոնցենտրացիայով), բացառությամբ նստեցված 2Rep-ի (նկ. 1b):Սա ենթադրում է, որ NT-ն և CT-ն առանձին-առանձին, համակցված կամ կապված կրկնությունների հետ, կարող են գել 37°C ջերմաստիճանում, և որ His6 պիտակը որևէ նշանակալի չափով չի ազդում այս գործընթացի վրա:Հաշվի առնելով ընդհանուր պատկերացումը, որ NT-ը խիստ լուծելի և կայուն սպիտակուց է, և որ նախորդ զեկույցները ռեկոմբինանտ սպիդրոյին հիդրոգելների մասին վերագրում էին ժելացիոն ազդեցությունները կրկնվող շրջաններում և/կամ CT-ների կոնֆորմացիոն փոփոխություններին, NT-ն ինքնին կարող էր:Գելացիայի հայտնաբերումն անսպասելի էր։Լրացուցիչ Աղյուսակ 1) 37, 38, 39. Հատկանշական է, որ NT-ն արդեն գել է 10 րոպեի ընթացքում ≥ 300 մգ/մլ կոնցենտրացիայով (նկ. 1c):ՆՏ-ի տարբեր կոնցենտրացիաներով սրվակի ինվերսիայի փորձերը ցույց են տվել, որ >50 մգ/մլ NT լուծույթն ավելի արագ դոնդողել է, քան His-NT2RepCT-ը համապատասխան կոնցենտրացիաներում (w/v, Նկար 1c):
Այս աշխատանքում ուսումնասիրված սպիդրոինի տարբեր կառուցվածքների սխեմատիկ ներկայացում:b Գելի ժամանակը 37 °C-ում տարբեր ռեկոմբինանտ սպիդրոին սպիտակուցների համար (300 մգ/մլ), որը ստուգվում է սրվակի շրջադարձով:CT գել անմիջապես առանց ինկուբացիայի (<300 մգ/մլ), 2Rep նստվածքներ (300 մգ/մլ, 5 մմ սանդղակ):c His-NT2RepCT-ի և NT-ի գելի ժամանակը նշված սպիտակուցի կոնցենտրացիաներում 37°C-ում:դ His-NT2RepCT և NT հիդրոգելների լուսանկարները, որոնց տակ համապատասխանաբար տպված է սարդը և «NT» տառը (երկուսն էլ՝ 200 մգ/մլ, սանդղակ՝ 5 մմ):
Տարբեր ռեկոմբինանտ սպիդրոին սպիտակուցներով ձևավորված հիդրոգելները մի փոքր տարբեր գույներ ունեն, և անզեն աչքով դիտումը ցույց է տալիս թափանցիկության տարբեր աստիճաններ (նկ. 1բ):NT գելերը բացառիկ թափանցիկ են, մինչդեռ մյուս գելերը դառնում են անթափանց:His-NT2RepCT և NT գելերը, որոնք ձուլվել են գլանաձև խողովակների մեջ, կարող են հեռացվել կաղապարից անձեռնմխելի (նկ. 1d):
Ստուգելու համար, թե արդյոք բնական սարդի մետաքսե ծածկույթները գել են այն պայմաններում, որոնք այժմ պարզվում է, որ առաջացնում են ռեկոմբինանտ սպիդրոինի սպիտակուցների ժելացիա, ծածկույթներ են հավաքվել շվեդական կամուրջ սարդի մեծ ամպուլա գեղձից (Larinioides sclopetarius):Ծածկույթները պահվել են 20 մՄ տրիս-HCl բուֆերում 50 մգ/մլ (չափված չոր քաշի հիման վրա), բայց 21-օրյա ինկուբացիայի ընթացքում 37 °C-ում ժելացիա չի նկատվել (Լրացուցիչ նկար 2ա):
Այս գելերը քանակականացնելու համար ռեոլոգիական չափումները կարող են օգտագործվել ժելացման գործընթացը ուսումնասիրելու և ընդհանուր մեխանիկական հատկությունները որոշելու համար:Մասնավորապես, բարձր ջերմաստիճաններում պահեստավորման մոդուլի (առաձգականության) մոնիտորինգը կարող է տեղեկատվություն տրամադրել գելման ջերմաստիճանի, ինչպես նաև ծածկույթի մածուցիկության հատկությունների մասին:Ջերմաստիճանի բարձրացման փորձերը (օգտագործելով 1°C/րոպե 25-45°C-ում, հիմնված նախորդ ուսումնասիրությունների վրա՝ օգտագործելով բնական մետաքսի լուծույթներ)40,41 ցույց տվեցին, որ His-NT2RepCT և NT լուծույթների պահպանման մոդուլները մեծանում են ջերմաստիճանի բարձրացման հետ:ավելացել է (նկ. 2 և լրացուցիչ նկ. 3):Հատկանշական է, որ NT մոդուլը սկսեց աճել ավելի ցածր ջերմաստիճանում, համեմատած His-NT2RepCT-ի հետ, որը համահունչ էր գելի ավելի արագ ժամանակին, որը նկատվում էր, երբ NT-ն ուղղակիորեն ինկուբացված էր His-NT2RepCT-ով 37°C-ում (Նկար 1):Ջերմաստիճանի հետագա անկումից հետո պահեստավորման մոդուլը չվերադարձավ ավելի ցածր արժեքներին և մնաց կորստի մոդուլից բարձր (տես Լրացուցիչ նկար 3), ինչը ցույց է տալիս ջերմային անդառնալի կայուն ժելացիա:Գելացումից հետո վերջնական առաձգական մոդուլը տատանվում էր 15-ից մինչև 330 կՊա His-NT2RepCT հիդրոգելների համար 100–500 մգ/մլ կոնցենտրացիայով, իսկ վերջնական առաձգական մոդուլը NT հիդրոգելների համար (100–500 մգ/մլ) տատանվում էր 2-ից մինչև 1400։ kPa (Նկար , 2 և թեքահարթակի ամբողջական տվյալները) տես Լրացուցիչ Նկար 3):
a Ջերմաստիճանի փոփոխություն His-NT2RepCT (300 մգ/մլ) և b NT (300 մգ/մլ) չափումների ժամանակ՝ թափահարելով:Սլաքները ցույց են տալիս ջերմաստիճանի միտումը, իսկ պահեստավորման մոդուլի տվյալների ավելի թեթև ստվերը ցույց է տալիս սարքի համար ավելի ցածր ոլորող մոմենտ արժեքներով փորձարկումը, քան նշված է արտադրողի կողմից, ինչը մեծ աղմուկի պատճառ է հանդիսանում:գ His-NT2RepCT-ի և NT-ի վերջնական մոդուլի կուտակում բարձր ջերմաստիճանից հետո (100, 300 և 500 մգ/մլ):Բոլոր մոդուլի ընթերցումները վերցվում են 0,1 Հց հաճախականությամբ:
Որպես գելացման հետ կապված կոնֆորմացիոն փոփոխությունների հետազոտման հնարավոր մեթոդ, մենք գրանցեցինք His-NT2RepCT-ի և NT-ի FTIR սպեկտրները ժելացումից առաջ և հետո 37°C-ում (Նկար 3ա, բ):Ինչպես և սպասվում էր, His-NT2RepCT և NT լուծույթների սպեկտրները համապատասխանում էին α-խխունջ/պատահական կծիկի երկրորդական կառուցվածք ցուցադրող սպիտակուցներին՝ 1645 սմ-1 ընդգծված շերտով:Երկու հիդրոգելների համար էլ ժելացումը հանգեցրեց I միջին շերտի երկու թևերի ձևավորմանը մոտ 1617 սմ-1 և 1695 սմ-1 (նկ. 3ա, բ), ինչը ցույց է տալիս հակազուգահեռ β-թերթային կառուցվածքների ձևավորումը:Այս փոփոխությունները կարելի է նաև հստակորեն տեսնել համապատասխան երկրորդ ածանցյալ և տարբեր գելացման սպեկտրներում (Լրացուցիչ Նկ. 4b):NT β-շերտի երկու շերտերն ավելի ցայտուն էին, քան His-NT2RepCT-ը, ինչը ցույց է տալիս, որ NT-ի հիդրոգելում β-շերտերի ընդհանուր պարունակությունը ավելի բարձր է, քան NT2RepCT հիդրոգելինը:
His-NT2RepCT-ի և b NT-ի (երկուսն էլ 500 մգ/մլ) կլանման սպեկտրը FTIR-ից առաջ (լուծույթ) և հետո (գել) ինկուբացիայից 37°C-ում:c TEM պատկերներ 50 մգ/մլ NT2RepCT գելերի և d NT-ի վերակապրած:Սանդղակի սանդղակը 200 նմ:ե His-NT2RepCT և NT հիդրոգելների մանրաթելերի տրամագծերը:n = 100 չափված մանրաթելեր, p <0,0001:Սխալների գծերը ցույց են տալիս ստանդարտ շեղումը:Սխալների գծերի կենտրոնը միջինն է:Վիճակագրական վերլուծության համար օգտագործվել է չզույգված t-թեստ (երկապոչ):f ThT տարբեր ռեկոմբինանտ սպիդրոին սպիտակուցների (100 մգ/մլ) ֆլյուորեսցենտացիա 37 °C-ում՝ առանց թափահարման:g NT (100 մգ/մլ) պատվաստման փորձեր 100 մգ/մլ NT գելից 0%, 5%, 10% և 20% սերմերով:
Գելի վերլուծությունը փոխանցման էլեկտրոնային մանրադիտակի միջոցով (TEM) ցույց տվեց, որ հիդրոգելը բաղկացած է ամիլոիդի նման մանրաթելերից (նկ. 3c, 3d):NT-ձևավորված մանրաթելերը երկարաձգվեցին (5–12 նմ տրամագծով) և չճյուղավորված, մինչդեռ His-NT2RepCT մանրաթելերն ավելի կարճ երկարությամբ և զգալիորեն ավելի լայն տրամագծով (7–16 նմ) էին (նկ. 3e):Այս արդյունքները մեզ թույլ տվեցին հետևել ֆիբրոզի կինետիկային՝ օգտագործելով թիոֆլավին T (ThT) վերլուծությունը:Բոլոր ռեկոմբինանտ սպիդրոյին սպիտակուցների դեպքում լյումինեսցենտային ազդանշանն ավելացել է, երբ նմուշները ինկուբացվել են 37 °C ջերմաստիճանում (նկ. 3f, Լրացուցիչ նկար 5ա):Այս բացահայտման համաձայն՝ NT-ի և His-NT2RepCT-ի մանրադիտակային հետազոտությունը գելման պայմաններում բացահայտեց ThT ֆլուորեսցենցիայի միատեսակ աճ՝ առանց ThT-դրական ագրեգատների նկատելի տեղային կուտակման (Լրացուցիչ նկար 5b,c):ThT-դրական մանրաթելերի ձևավորումը չի ուղեկցվել NT և His-NTCT պղտորության ավելացմամբ (Լրացուցիչ Նկ. 5d), ինչը նշանակում է, որ գելի մեջ մանրաթելերի ցանց կարող է ձևավորվել առանց գելի հստակության խախտման:Փոքր քանակությամբ նախապես ձևավորված մանրաթելերի ավելացմամբ ցանելը կարող է զգալիորեն արագացնել որոշ ամիլոիդների ֆիբրիլների ձևավորումը42,43,44, բայց ավելացնելով 5%, 10% կամ 20% (w/w) NT NT hydrocoagulants-ի լուծույթին:սերմնացան ազդեցություն (նկ. 3գ):Թերևս դա պայմանավորված է նրանով, որ հիդրոգելի մեջ մանրաթելերը համեմատաբար ամրացված են և չեն կարող օգտագործվել որպես սերմեր:
Բարձր ջերմաստիճաններում ռեկոմբինանտ սպիդրոյին սպիտակուցների անսպասելի վարքագիծը խթանեց հետագա միջուկային մագնիսական ռեզոնանսային (NMR) սպեկտրոսկոպիայի ուսումնասիրությունները՝ բացահայտելու կոնֆորմացիոն փոփոխությունները, որոնք կապված են գելի ձևավորման հետ:His-NT2RepCT լուծույթների NMR սպեկտրները, որոնք գրանցված են ժամանակի ընթացքում 37°C-ում, ցույց են տվել, որ CT-ն դեռ մասամբ ծալված է, մինչդեռ NT և 2Rep ազդանշաններն անհետացել են (նկ. 4ա), ինչը ենթադրում է, որ հիմնականում NT և 2Rep-ն է, որ մասնակիորեն վերահսկում է His--ի ձևավորումը: NT2RepCT հիդրոգել:CT ազդանշանը նույնպես թուլացել է իր սկզբնական ինտենսիվության 20%-ով, ինչը ենթադրում է, որ CT-ն նույնպես հիմնականում ամրագրված է և ներառված է հիդրոգելի կառուցվածքում:CT-ի ավելի փոքր մասի համար, որը նույնքան շարժուն է, որքան նախաինկուբացված նմուշում և, հետևաբար, դիտարկվում է NMR լուծույթով, սպեկտրում բացակայում են ազդանշաններ առաջին 10 կառուցվածքային մնացորդների համար, հնարավոր է, որ His-NT2Rep-ի կցված մասի դժվար անշարժացումը պայմանավորված է:Հիդրոգելների վիճակի NMR սպեկտրները՝ NT2RepCT, բացահայտեցին α-պարույրների և β-շերտերի գերակշռող ներկայությունը և, ավելի փոքր չափով, կծիկի պատահական կոնֆորմացիան (նկ. 4b):Միայն NT-ում առկա մեթիոնինի մնացորդների քիմիական հերթափոխի վերլուծությունը ցույց տվեց, որ այս տիրույթը վերածվել է β-թերթի կառուցվածքի:Լուծման մեջ NT-ի ժամանակից կախված սպեկտրները ցույց են տվել ազդանշանի ինտենսիվության միատեսակ նվազում (նկ. 4c), իսկ NT հիդրոգելների պինդ վիճակի NMR-ը ցույց է տվել, որ NT մնացորդների մեծ մասը վերածվել է β-թերթային կառուցվածքների (նկ. 4d):2Rep-ի համապատասխանությունը չի կարող առանձին որոշվել՝ ագրեգացման միտումի պատճառով:Այնուամենայնիվ, NTCT և His-NT2RepCT հիդրոգելների պինդ վիճակի NMR սպեկտրները շատ նման էին (Նկար 4b; Լրացուցիչ Նկ. 6b), ինչը ենթադրում է, որ 2Rep-ը քիչ է նպաստել His-NT2RepCT հիդրոգելի կառուցվածքային մասին:CT հիդրոգելների համար հայտնաբերվել են α-պարուրակներ, β-թերթիկներ և պատահական պարուրաձև երկրորդական կառուցվածքներ (Լրացուցիչ նկար 6d):Սա ենթադրում է, որ CT-ի որոշ հատվածներ մնում են α-պարուրակներ, իսկ մյուսները դառնում են β-թերթիկներ:Այսպիսով, NMR սպեկտրոսկոպիայի արդյունքները ցույց են տալիս, որ NT-ը կարևոր է հիդրոգելի ձևավորման համար, ինչպես նաև փոխակերպվում է β-թերթի կոնֆորմացիայի՝ 2Rep-ի և CT-ի հետ միաձուլման ժամանակ:Համապատասխանաբար, մենք վերջերս պարզեցինք, որ ամիլոիդ տարածական կայծակաճարմանդները, հավանաբար, ձևավորվում են NT տիրույթի բոլոր հինգ պարույրներում, և Վալսի ալգորիթմը կանխատեսում էր ամիլոիդոգեն շրջան 1-ին պարույրում (նկ. 4e):
15N-HSQC 10 մգ/մլ His-NT2RepCT լուծույթի 2D սպեկտրներ (կապույտ) և ինկուբացիայից հետո 19 ժամ հետո (կարմիր) 37°C-ում:Առանձին խաչաձև գագաթներ կարմիր սպեկտրում և F24, G136, polyA կապույտ սպեկտրում նշվում են միատառ ամինաթթուների նշաններով և մնացորդային թվերով:Ներդիրները ցույց են տալիս ազդանշանի ինտենսիվության կախվածությունը ժամանակից ընտրված մնացորդների համար NT, 2Rep և CT տիրույթներից:b His-NT2RepCT հիդրոգելների պինդ վիճակի ռադիոհաճախականության (RFDR) սպեկտրները:RFDR սպեկտրներում նկատված Ca/Cβ մնացորդների հարաբերակցությունը որոշվել է մոդելային պեպտիդային քիմիական տեղաշարժերի և վիճակագրությունից ստացված արժեքների համեմատությամբ82,83 և դրանց երկրորդական կառուցվածքներով:SSB - պտտվող կողային գոտի:գ 15N-HSQC 10 մգ/մլ NT լուծույթի միաչափ սպեկտրներ 37 °C-ում 36 ժամ ինկուբացիայի ժամանակ:Ներդիրը ցույց է տալիս ծավալային ինտենսիվությունը ժամանակի համեմատ:դ NT հիդրոգելների պինդ վիճակի RFDR սպեկտրները:Ցուցված են RFDR սպեկտրում նկատված Ca/Cβ մնացորդների և դրանց երկրորդական կառուցվածքների հարաբերակցությունը:e Հիմնված է Zipper տվյալների բազայից (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT45.79 ֆիբրիլյացիայի հակվածության պրոֆիլի վրա:Հեքսապեպտիդի տարածական կայծակնային հերթափոխի պատուհանի Ռոզետայի էներգիան ցուցադրվում է կկալ/մոլով:Կարմիր գծերը ցույց են տալիս ֆիբրոզի բարձր հակում ունեցող հեքսապեպտիդներ (Ռոզետայի էներգիան -23 կկալ/մոլից ցածր, կետավոր գծից ցածր):Կանաչ գծերը ցույց են տալիս Ռոզետայի էներգիայով բեկորները շեմից բարձր և, հետևաբար, ավելի քիչ հավանական է, որ կձևավորեն ստերիկ կայծակաճարմանդներ:Պրոլին պարունակող բեկորները բացառվել են վերլուծությունից (առանց սյունակների):Քառակուսիները ցույց են տալիս ամիլոիդոզի տարածքները, որոնք կանխատեսվել են Վալսի ալգորիթմի կողմից81 (https://waltz.switchlab.org):ՆՏ-ի ամինաթթուների մնացորդների հաջորդականությունը վերևում է, իսկ β երկրորդական կառուցվածքում հայտնաբերված մնացորդների տեսակները (որոշվում են պինդ վիճակում NMR սպեկտրոսկոպիայի միջոցով) ցուցադրվում են կարմիրով:Հինգ NT α-պարույրների դիրքերը նշանակված են որպես (H1-H5)28:
<6,5 pH-ի դեպքում HT-ն երկիմիզանում է՝ լինելով դիմացկուն ջերմային կամ միզանյութով առաջացած դենատուրացիայի նկատմամբ18:Պարզելու համար, թե ինչպես են NT դիմերիզացիան և կայունությունը ազդում ժելացման վրա, 100 մգ/մլ NT պարունակող լուծույթները վերահսկվել են pH 8, 7 և 6՝ օգտագործելով սրվակի ինվերսիոն թեստը:NT նմուշները ինկուբացվել են pH 8 և 7 ջերմաստիճանում 30 րոպե հետո 37 °C ջերմաստիճանում, սակայն pH 8 գելը մնացել է մաքուր, մինչդեռ pH 7 գելը ցույց է տվել տեսանելի նստվածք (նկ. 5ա):Ի հակադրություն, pH 6-ում HT պարունակող լուծույթը գել չի ձևավորել, և մեծ նստվածք կարելի է տեսնել 20 րոպե հետո 37°C ջերմաստիճանում:Սա հուշում է, որ դիմերներն իրենք և/կամ դրանց ավելի բարձր կայունությունը մոնոմերների համեմատ կանխում են ժելացումը:NT-ի համար նստվածքի ձևավորումը pH 7 և 6-ում չէր սպասվում, քանի որ հաղորդվել է, որ NT-ն լուծվում է 200 մգ/մլ27-ում, հեշտությամբ վերապատվում է ջերմային դենատուրացիայից հետո, ինչպես նաև պահպանում է α-խխունջ ավելի ցածր արժեքներով: pH 18: Այս անհամապատասխանությունների հավանական բացատրությունն այն է, որ նախկինում հաղորդված փորձերն իրականացվել են սենյակային ջերմաստիճանում կամ ավելի ցածր, կամ սպիտակուցի համեմատաբար ցածր կոնցենտրացիաներում16,18,19:
NT սրվակի ինվերսիայի թեստ (100 մգ/մլ) pH 8, 7, 6 և 154 մՄ NaCl (pH 8) 37°C-ում ինկուբացիայից հետո:b NT CD սպեկտրները համապատասխանաբար 154 մՄ NaF և 154 մՄ NaCl-ով և առանց դրանց:222 նմ մոլային էլիպտիկությունը վերածվում է բնական ծալքերի համամասնության:c NT ինվերսիայի վերլուծություն (100 մգ/մլ) NT* (37 °C և 60 °C), NTA72R (37 °C) և His-NT-L6 (37 °C և 60 °C):d NT մուտանտների NT*, NTA72R և His-NT-L6 մուտանտների CD սպեկտրները:222 նմ մոլային էլիպտիկությունը վերածվում է բնական ծալքերի համամասնության:e NTFlSp-ի, NTMiSp-ի և կրճատված NTMiSp-ի ինվերսիոն փորձարկում (100 մգ/մլ):Կշեռքի բար 5 մմ:f NT, NTFlSp, NTMiSp և կրճատված NTMiSp-ի CD սպեկտրները:222 նմ մոլային էլիպտիկությունը վերածվում է բնական ծալքերի համամասնության:Ամբողջական NT սպեկտրները 25 °C և 95 °C ջերմաստիճանում ներկայացված են Լրացուցիչ Նկար 8-ում:
Ֆիզիոլոգիական աղի կոնցենտրացիան որոշում է էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությունները NT ենթամիավորների միջև և NT-ի դիմերացումը դեպի ցածր pH18:Մենք գտանք, որ 154 մՄ NaCl-ի և NaF-ի առկայությունը, համապատասխանաբար, իսկապես արգելակում է ժելացումը (Նկար 5a, b; Լրացուցիչ Նկ. 2b) և որ այս աղերը մեծացնում են NT մոնոմերների ջերմային կայունությունը (Նկար 5b, Լրացուցիչ նկ. 8): .Այն նաև հուշում է, որ կայունության բարձրացումը, այլ ոչ թե դիմերիզացումը, կանխում է գելի ձևավորումը:
Գելացման մեջ սպիտակուցի դիմերացման և կայունության դերը հետագայում ուսումնասիրելու համար մենք օգտագործեցինք երկու մուտանտներ՝ NT* և NTA72R, որոնք նույնպես մնում են մոնոմեր ցածր pH28.30-ում:NT*-ը կրկնակի լիցքի հակադարձ մուտանտ է, որտեղ մոնոմերի ակնհայտ երկբևեռ լիցքի բաշխումը հարթեցված է, ինչը կանխում է դիմերիզացումը և կտրուկ մեծացնում մոնոմերի կայունությունը:NTA72R-ը լիցքավորված դիպոլ է, բայց Arg-ով փոխարինված Ala-ն գտնվում է դիմերի սահմանին, ուստի մուտացիաները խանգարում են ենթամիավորի փոխազդեցություններին, որոնք անհրաժեշտ են դիմերիզացման համար:37°C-ում ինկուբացիայից հետո NT*-ը հիդրոգել չի առաջացրել, մինչդեռ NTA72R-ը 15 րոպեի ընթացքում անթափանց գել է ձևավորել (նկ. 5c):Քանի որ և՛ NT*, և՛ NTA72R-ը չեն կարող կիսվել, բայց տարբերվում են մոնոմերի կայունությամբ (նկ. 5d), այս արդյունքները վճռականորեն ցույց են տալիս, որ բարձր թերմոդինամիկական կայունությունը կանխում է NT-ի ժելլումը:Դրան է նպաստում նաև այն փաստը, որ HT*-ը գել է ձևավորում, երբ այն անկայուն է բարձր ջերմաստիճանում (8 րոպե հետո 60°C-ում, նկ. 5c):Նախկինում ցույց է տրվել, որ NT-ում մեթիոնինի բարձր պարունակությունը հեղուկացնում է նրա բնական ծալումը, և որ վեց Met-ի Leu փոխարինիչներ (այստեղ նշված է որպես His-NT-L6) խիստ կայունացնում են NT46 մոնոմերը:Ելնելով այն ենթադրությունից, որ կառուցվածքային ճկունություն է պահանջվում NT գելի ձևավորման համար, մենք պարզեցինք, որ His-NT-L6 կայուն մուտանտը չի գել 37 °C ջերմաստիճանում (Նկար 5c, d):Այնուամենայնիվ, His-NT-L6-ը նաև գել է ձևավորել 60°С-ում 60 րոպե ինկուբացիայից հետո (նկ. 5c):
NT-ի կարողությունը վերափոխվելու β-թերթային կառուցվածքների և ձևավորելու հիդրոգելներ, թվում է, որ կիրառվում է սպիդրոինի որոշ, բայց ոչ բոլոր NT տիրույթների վրա:Մետաքսի տարբեր տեսակներից և սարդերի տեսակներից NT-ները՝ Trichonephila clavipes (NTFlSp), գոյացրին գելեր՝ չնայած դրանց համեմատաբար ցածր մեթիոնինի պարունակությանը և բարձր ջերմային կայունությանը (նկ. 5e, f և լրացուցիչ Աղյուսակ 2):Ի հակադրություն, ցածր ջերմային կայունությամբ և մեթիոնինի բարձր պարունակությամբ Araneus ventricosus-ից (NTMiSp) փոքր ամպուլյար սպիտակուցից NT-ն չի ձևավորել հիդրոգելներ (Լրացուցիչ աղյուսակ 2 և նկ. 5e, f):Վերջինս կարող է կապված լինել ներմոլեկուլային դիսուլֆիդային կապերի առկայության հետ29,47:Հետևողականորեն, երբ NTMiSp-ի դիսուլֆիդային կապերը կրճատվեցին, այն ձևավորեց հիդրոգել 37°C-ում 10 րոպե ինկուբացիայից հետո (նկ. 5e):Եզրափակելով, հարկ է նշել, որ կառուցվածքային ճկունությունը կարևոր, բայց ոչ միակ չափանիշն է NT-ից գելի ձևավորման համար:Մեկ այլ գործոն, որը կարող է տեղին լինել ամիլոիդ ֆիբրիլներ ձևավորելու հակումն է, և կայծակաճարմանդ տվյալների բազայի և Վալսի ալգորիթմի հետ վերլուծությունը ցույց տվեց կապը գելեր ձևավորելու ունակության և ամիլոիդոգեն շրջանների առկայության, ինչպես նաև կանխատեսված շրջանների միջև: ստերիկ կայծակաճարմանդներ ձևավորելու համար:Եղել է հարաբերակցություն (Լրացուցիչ Աղյուսակ 2 և Լրացուցիչ Նկ. 9):
ՆՏ-ի ֆիբրիլներ ձևավորելու և բարենպաստ պայմաններում գելեր ձևավորելու ունակությունը մեզ հանգեցրեց այն վարկածին, որ NT միաձուլումը սպիտակուցի այլ բեկորների հետ դեռ կարող է ձևավորել գելեր՝ միաձուլման գործընկերների լիարժեք գործառույթով:Սա փորձարկելու համար մենք ներմուծեցինք կանաչ լյումինեսցենտ սպիտակուց (GFP) և պուրին նուկլեոզիդ ֆոսֆորիլազա (PNP) համապատասխանաբար NT-ի C-վերնամասում:Ստացված միաձուլման սպիտակուցներն արտահայտվել են E. coli-ում՝ շատ բարձր վերջնական ելքով (150 մգ/լ և 256 մգ/լ թափահարման կոլբայի մշակույթներ՝ համապատասխանաբար His-NT-GFP-ի և His-NT-PNP-ի համար), որը համապատասխանում է ցուցադրվածին: այլ սպիտակուցների համար, որոնք միաձուլված են NT-ի հետ.30. His-NT-GFP (300mg/mL) և His-NT-PNP (100mg/mL) միաձուլման սպիտակուցները 2 ժամ և 6,5 ժամ հետո 37°C-ում ձևավորել են գելեր, և, որ կարևոր է, GFP ֆրակցիան մնացել է անփոփոխ:դիտվել է ժելացումից հետո, որի սկզբնական ֆլուորեսցենտային ինտենսիվության >70%-ը մնում է ժելացումից հետո (նկ. 6ա):PNP-ի ակտիվությունը his-NT-PNP լուծույթներում և գելերում չափելու համար մենք պետք է նոսրացրինք միաձուլման սպիտակուցը NT-ով, քանի որ մաքուր պատրաստուկի ֆերմենտային ակտիվությունը դուրս էր վերլուծության հայտնաբերման միջակայքից գելացման կոնցենտրացիաներում:0.01 մգ/մլ His-NT-PNP և 100 մգ/մլ NT պարունակող խառնուրդով ձևավորված գելը պահպանեց նախաինկուբացված նմուշների սկզբնական ֆերմենտային ակտիվության 65%-ը (նկ. 6b):Չափման ընթացքում գելը մնաց անփոփոխ (Լրացուցիչ նկար 10):
His-NT-GFP-ի (300 մգ/մլ) և շրջված սրվակի, որը պարունակում է His-NT-GFP հիդրոգել (300 մգ/մլ) տեսանելի և ուլտրամանուշակագույն լույսի ներքո, ֆլյուորեսցենցիայի հարաբերական ինտենսիվությունը առաջ և հետո:Կետերը ցույց են տալիս անհատական չափումներ (n = 3), սխալի գծերը ցույց են տալիս ստանդարտ շեղում:Միջին արժեքը ցուցադրվում է սխալի գծերի կենտրոնում:b PNP-ի ակտիվությունը ստացվել է ֆտորոմետրիկ անալիզի միջոցով՝ օգտագործելով NT (100 մգ/մլ) և 0,01 մգ/մլ his-NT-PNP և 100 մգ/մլ նոր թայվանական դոլարներ պարունակող լուծույթներ և գելեր:Ներդիրը ցույց է տալիս շրջված սրվակ, որը պարունակում է հիդրոգել, որը պարունակում է His-NT-PNP (5 մմ սանդղակի բար):
Այստեղ մենք հայտնում ենք NT-ից և այլ ռեկոմբինանտ սպիդրոյին սպիտակուցներից հիդրոգելների ձևավորման մասին՝ ինկուբացնելով սպիտակուցային լուծույթը 37°C-ում (Նկար 1):Մենք ցույց ենք տալիս, որ ժելացումը կապված է α-պարուրակների փոխակերպման β-շերտերի և ամիլոիդանման մանրաթելերի ձևավորման հետ (նկ. 3 և 4):Այս բացահայտումը զարմանալի է, քանի որ NT-ները գնդաձև գնդաձև հինգ պարուրաձև կապոցներ են, որոնք հայտնի են իրենց չափազանց բարձր լուծելիությամբ և բարձր կայունությամբ ավելի քան 200 մգ/մլ կոնցենտրացիաներում մի քանի օրվա ընթացքում 4°C-ում27:Ի լրումն, NT-ները հեշտությամբ ծալվում են ջերմային դենատուրացիայից հետո սպիտակուցի ցածր կոնցենտրացիաներում μM-ում:Մեր արդյունքների համաձայն, ֆիբրիլների առաջացումը պահանջում է >10 մգ/մլ սպիտակուցի կոնցենտրացիայի և մի փոքր բարձր ջերմաստիճանի համադրություն (նկ. 1):Սա համահունչ է այն մտքին, որ ամիլոիդ մանրաթելերը կարող են ձևավորվել գնդաձև ծալված սպիտակուցներից, որոնք մասնակիորեն բացված վիճակում են ֆիզիոլոգիական պայմաններում ջերմային տատանումների պատճառով 48:Այս փոխակերպման ենթարկվող սպիտակուցների օրինակները ներառում են ինսուլին49,50, β2-միկրոգլոբուլին, տրանսթիրետին և լիզոզիմ51,52,53:Թեև NT-ն իր բնիկ վիճակում α-խխունջ է, պոլիպեպտիդային շղթայի մոտավորապես 65%-ը համատեղելի է ստերիկ կայծակաճարմանդ ձևավորման հետ (նկ. 4e) 45:Քանի որ մոնոմերը դինամիկորեն շարժուն է46, այն կարող է բացահայտել այս պոտենցիալ ամիլոիդոգեն շրջանները չափավոր բարձր ջերմաստիճաններում, իսկ ընդհանուր սպիտակուցի բարձր կոնցենտրացիաների դեպքում կարող է հասնել կրիտիկական կոնցենտրացիայի ամիլոիդ ֆիբրիլների ձևավորման համար54:Հետևելով այս պատճառաբանությանը, մենք գտանք բացասական հարաբերակցություն սպիդրոինի կոնցենտրացիայի և ժելացման ժամանակի միջև (նկ. 1c), և եթե մոնոմերային NT կոնֆորմացիան կայունացվի կամ մուտացիաների (NT*, His-NT-L6) կամ աղի ավելացման միջոցով, կարող է կանխել առաջացման հիդրոգելներ (նկ. 5):
Շատ դեպքերում ամիլոիդային մանրաթելերը անհետանում են լուծույթից որպես նստվածք, սակայն որոշակի պայմաններում կարող են առաջացնել հիդրոգելներ55,56,57:Հիդրոգել ձևավորող մանրաթելերը սովորաբար ունեն բարձր հարաբերակցություն և ձևավորում են կայուն եռաչափ ցանցեր մոլեկուլային խճճվածության միջոցով, 55,58 համապատասխան մեր արդյունքներին:In vitro հիդրոգելի ձևավորման համար սպիտակուցները հաճախ ամբողջությամբ կամ մասնակիորեն բացվում են, օրինակ՝ օրգանական լուծիչների ազդեցության, բարձր ջերմաստիճանի (70–90°C) և/կամ ցածր pH-ի (1,5–3,0) 59,60,61,62 ազդեցության միջոցով։Այստեղ նկարագրված սպիդրոին հիդրոգելները չեն պահանջում կոշտ մշակում, ոչ էլ պահանջում են խաչաձև կապող նյութեր՝ հիդրոգելները կայունացնելու համար:
Նախկինում հաղորդվել էր, որ spidroin-ի կրկնվողները և QD-ները, որոնք կարծես թե ենթարկվում են β-թերթի փոփոխության մետաքսի մանման ժամանակ, ձևավորում են հիդրոգելներ:Համեմատած մեր գտածոների հետ՝ ինկուբացիոն ժամանակները և/կամ ինկուբացիոն ջերմաստիճանները համապատասխանաբար զգալիորեն ավելի երկար կամ ավելի բարձր էին, և ստացված հիդրոգելները հաճախ անթափանց էին (Նկար 7 և Լրացուցիչ Աղյուսակ 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68: , 69. Ի հավելումն արագ գելի ժամանակների, NT հիդրոգելները >300 մգ/մլ (30%) գերազանցում են նկարագրված բոլոր նկարագրված ռեկոմբինանտ սարդի մետաքսի սպիտակուցի հիդրոգելներին, ինչպես նաև բնական հիդրոգելներին, ինչպիսիք են ժելատինը, ալգինատը (2%), ագարը (0,5%): ) և կոլագեն:(0.6%) (Նկար 7 և Լրացուցիչ Աղյուսակներ 1 և 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74:
Այս հետազոտության մեջ հիդրոգելների գելի ժամանակը և առաձգական մոդուլը համեմատվել են սպիդրոյնի վրա հիմնված այլ հիդրոգելների և ընտրված բնական հիդրոգելների հետ:Հղումները տրվում են ժելացման պայմանների նկարագրության հետ մեկտեղ:APS Ամոնիումի պերսուլֆատ, սենյակային ջերմաստիճան:Տվյալներ 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74:
Սարդերը, ըստ երևույթին, մշակել են միջոցներ՝ կանխելու սպիդրոինի գելացումը պահեստավորման ընթացքում:Չնայած մետաքսի գեղձում սպիտակուցի բարձր կոնցենտրացիային, տերմինալ տիրույթի հետ կապված մեծ կրկնվող շրջանը նշանակում է, որ NT-ի և CT-ի ակնհայտ կոնցենտրացիան գեղձում համապատասխանում է մոտավորապես 10-20 մգ/մլ՝ այս հետազոտության սահմանին:անհրաժեշտ է in vitro դիտարկվող հիդրոգելի ձևավորման համար:Բացի այդ, աղերի նմանատիպ կոնցենտրացիաները 16 կայունացրել են NT, ինչպես մետաքսի խցուկներում (նկ. 5b):NT կոնֆորմացիան ուսումնասիրվել է E. coli ցիտոզոլում և պարզվել է, որ այն ավելի ամուր է ծալված, քան in vitro հետազոտության ժամանակ, ինչը հետագայում ցույց է տալիս, որ աղը կամ այլ գործոններ կանխում են դրա ագրեգացումը in vivo-ում:Այնուամենայնիվ, NT-ների կարողությունը վերափոխվելու β-թերթաթելային մանրաթելերի կարող է կարևոր լինել թելերի ձևավորման համար և պետք է ուսումնասիրվի ապագա ուսումնասիրություններում:
Ի լրումն այս ուսումնասիրության մեջ նկատված NT-ամիլոիդի նման ֆիբրիլների և հիդրոգելի ձևավորման նոր ասպեկտներին, մենք նաև ցույց ենք տալիս, որ այս երևույթը կարող է ունենալ կենսատեխնոլոգիական և կենսաբժշկական կիրառություններ (նկ. 8):Որպես հայեցակարգի ապացույց, մենք համակցեցինք NT-ն GFP-ի կամ PNP-ի հետ և ցույց տվեցինք, որ միաձուլման սպիտակուցը նաև հիդրոգելներ է ստեղծում, երբ ինկուբացվում է 37 °C-ում, և որ GFP և PNP ֆրակցիաները մեծապես պահպանում են իրենց ակտիվությունը ժելացումից հետո (Նկար 6):Նուկլեոզիդային ֆոսֆորիլազները նուկլեոզիդային անալոգների սինթեզի կարևոր կատալիզատորներ են75, ինչը մեր հայտնագործությունը դարձնում է ակտուալ կենսադեղագործական արդյունաբերության համար:Բարենպաստ պայմաններում թափանցիկ հիդրոգելներ ձևավորող միաձուլված սպիտակուցների արտահայտման հայեցակարգը թույլ է տալիս ստեղծել ֆունկցիոնալացված հիդրոգելներ՝ բարենպաստ հատկություններով կիրառությունների լայն շրջանակի համար, ինչպիսիք են ֆերմենտների անշարժացումը, դեղերի վերահսկվող արտազատումը և հյուսվածքների ճարտարագիտությունը:Բացի այդ, NT և NT*-ն արտահայտման արդյունավետ մարկերներ են30, ինչը նշանակում է, որ NT և դրա տարբերակները կարող են օգտագործվել լուծվող միաձուլման սպիտակուցների բարձր թողունակության արտադրության և 3D հիդրոգելներում անշարժացված թիրախային սպիտակուցների ստեղծման համար:
ՆՏ-ը լուծելի է, α-պտուտակաձև և կայուն ցածր կոնցենտրացիաներում (մկմ) և 37°C ջերմաստիճանում:Նույն ջերմաստիճանում, բայց աճող կոնցենտրացիաների դեպքում (> 10 մգ/մլ), NT-ն ձևավորում է գելեր, որոնք բաղկացած են ամիլոիդային մանրաթելերից։NT միաձուլման սպիտակուցները նաև ձևավորում են ֆիբրիլային գելեր՝ լիովին ֆունկցիոնալ միաձուլման բեկորներով, ինչը թույլ է տալիս տարբեր սպիտակուցներ անշարժացնել 3D հիդրոգելներում՝ օգտագործելով NT:Ներքևում` NT (PDB: 4FBS) և մանրաթելային ցանցերի և հարակից սպիտակուցային կառուցվածքների նկարազարդումներ (ենթադրվում է և չի գծված մասշտաբով, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2pdbd21):
Կառուցվածքները (տես Լրացուցիչ Աղյուսակ 4 ամբողջական ցանկի համար՝ ներառյալ ամինաթթուների հաջորդականությունը) կլոնավորվել են պլազմիդի pT7-ի մեջ և վերածվել E. coli BL21 (DE3):E. coli-ն պարունակող ինժեներական պլազմիդներ պատվաստվել են Luria արգանակում՝ համալրված կանամիցինով (70 մգ/լ) և աճեցվել մեկ գիշերվա ընթացքում 30°C և 250 rpm-ում:Այնուհետև մշակույթը 1/100-ով պատվաստվել է կանամիցին պարունակող LB միջավայրում և մշակվել 30°C-ում և 110 պտ/րոպում, մինչև OD600-ը հասնի 0,8-ի:NMR ուսումնասիրությունների համար բակտերիաները աճեցվել են M9 նվազագույն միջավայրում, որը պարունակում է 2 գ D-գլյուկոզա 13C (Aldrich) և 1 գ ամոնիումի քլորիդ 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.)՝ իզոտոպներով սպիտակուցների պիտակավորման համար:Ջերմաստիճանն իջեցնել մինչև 20 աստիճան Ցելսիուս և առաջացնել սպիտակուցի արտահայտում 0,15 մՄ իզոպրոպիլթիոգալակտոպիրանոզիդով (վերջնական կոնցենտրացիան):Գիշերային սպիտակուցի արտահայտումից հետո բջիջները հավաքվել են 7278 × գ, 4°C ջերմաստիճանում 20 րոպեի ընթացքում:Բջջային գնդիկները կրկին կասեցվել են 20 մՄ տրիս-HCl-ում, pH 8 և սառեցվել մինչև հետագա օգտագործումը:Հալեցրած բջիջները լիզվել են՝ օգտագործելով բջիջների խանգարիչ (TS շարքի մեքենաներ, Constant Systems Limited, Անգլիա) 30 կՊա:Այնուհետև լիզատները ցենտրիֆուգվել են 25000 գ 30 րոպե 4°C-ում:NTMiSp-ի համար գնդիկը այնուհետև նորից կասեցվեց 2 մ միզանյութում, 20 մՄ տրիս-HCl, pH 8, և 2 րոպե լուծվեց (2 վրկ միացում/անջատում, 65%), այնուհետև նորից ցենտրիֆուգվեց 25000 xg, 4°C ջերմաստիճանում: 30 րոպեՎերևը բեռնվեց Ni-NTA սյունակի վրա, լվացվեց 20 մՄ Տրիս-HCl, 2 մՄ իմիդազոլով, pH 8, և վերջապես սպիտակուցը լվացվեց 20 մՄ Տրիս-HCl, 200 մՄ իմիդազոլով, pH 8: NT2RepCT և NTCT, թրոմբինային մարսողությունը ներկայացնում է տեղանքը (ThrCleav) His-ի և NT-ի միջև:Թրոմբինի տրոհման տեղամասերը առկա են նաև His-NT-ThrCleav-2Rep (արտադրում է 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (արտադրում է NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (արտադրում է CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT: .* (արտադրում է NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (արտադրում է NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (արտադրում է NTF1Sp) և His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (արտադրում է):Կառուցվածքները մարսվել են թրոմբինով (1:1000) և դիալիզացվել են գիշերվա ընթացքում 4°C-ում: 20 մՄ տրիս-HCl, pH 8, օգտագործելով Spectra/Por դիալիզի թաղանթ՝ 6-8 կԴա մոլեկուլային քաշի շեմով:Դիալիզից հետո լուծույթը բեռնվում է Ni-NTA սյունակի վրա և հավաքվում է հետաքրքրող սպիտակուցը պարունակող արտահոսքը:Սպիտակուցի կոնցենտրացիաները որոշվել են 280 նմ ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման կլանման չափման միջոցով՝ օգտագործելով յուրաքանչյուր սպիտակուցի մարման գործակիցը, բացառությամբ NTF1Sp-ի, որն օգտագործում էր Բրեդֆորդի վերլուծությունը՝ ըստ արտադրողի արձանագրության:Մաքրությունը որոշվել է SDS polyacrylamide (4–20%) գելային էլեկտրոֆորեզով և Coomassie-ի փայլուն կապույտ գունավորմամբ:Սպիտակուցները խտացվել են ցենտրիֆուգային ֆիլտրերի միջոցով (VivaSpin 20, GE Healthcare) 4000 xg-ով 10 կԴա մոլեկուլային քաշով 20 րոպե ցիկլով:
Հալեցրեք սպիտակուցի լուծույթը և 150 մկլ զգուշորեն պիպերտացրեք 1 մլ թափանցիկ միջնապատի սրվակի մեջ (8 x 40 մմ Thermo Scientific):Խողովակները փակվեցին և փակվեցին պարաֆիլմով, որպեսզի կանխեն գոլորշիացումը:Նմուշները (n = 3) ինկուբացվել են 37°C կամ 60°C ջերմաստիճանում և պարբերաբար շրջվել՝ ժելացումը դիտարկելու համար:Նմուշները, որոնք չեն գելացել, ինկուբացվել են առնվազն մեկ շաբաթ:Կրճատեք NTMiSp դիսուլֆիդային կապերը 10 մՄ DTT 10 մկմ սպիտակուցի դիմաց:Սարդի բնական մետաքսե ծածկույթների ժելացումը վերլուծելու համար կտրվեց շվեդական կամուրջ սարդը, երկու հիմնական ամպուլացված խցուկները տեղադրվեցին 200 մկլ 20 մՄ Tris-HCl բուֆերային pH 8-ի մեջ և կտրվեցին, որպեսզի ծածկույթը առանձնանա խցուկներից:.Խցուկների պարունակությունը լուծվում է բուֆերի մեջ, 50 մկլ՝ չոր քաշը որոշելու համար (բաց սրվակների ինկուբացիայի միջոցով 60 °C մինչև մշտական քաշը) և 150 մկլ՝ 37 °C ժելացիայի համար:
Չափիչ երկրաչափությունը/գործիքը պատրաստված է չժանգոտվող պողպատից՝ օգտագործելով զուգահեռ ափսե՝ 20 մմ վերին տրամագծով և 0,5 մմ բացվածքով:Նմուշը տաքացրեք 25 °C-ից մինչև 45 °C և նորից մինչև 25 °C րոպեում 1 °C արագությամբ՝ օգտագործելով չժանգոտվող պողպատից ներքևի Peltier ափսե:Վիբրացիոն չափումներ են իրականացվել 0,1 Հց հաճախականությամբ և նյութի գծային viscoelastic շրջանում՝ համապատասխանաբար 100 մգ/մլ և 300–500 մգ/մլ նմուշների համար 5% և 0,5% լարվածությամբ:Գոլորշիացումը կանխելու համար օգտագործեք հատուկ խոնավության խցիկ:Տվյալները վերլուծվել են Prism 9-ի միջոցով:
Ինֆրակարմիր (IR) սպեկտրները սենյակային ջերմաստիճանում 800-ից 3900 սմ–1 հավաքելու համար:ATR սարքը, ինչպես նաև սպեկտրոմետրով անցնող լույսի ուղին, փորձարկումից առաջ և ընթացքում մաքրվում է չոր զտված օդով:Լուծումները (500 մգ/մլ՝ ջրի կլանման գագաթները սպեկտրում նվազագույնի հասցնելու համար) պիպետտացվել են բյուրեղների վրա, իսկ չափումից առաջ ձևավորվել են գելեր (500 մգ/մլ), այնուհետև փոխանցվել բյուրեղներին (n = 3):Գրանցվել է 1000 սկանավորում 2 սմ-1 լուծաչափով և 2 զրոյական աշխատանքային ցիկլով: Երկրորդ ածանցյալը հաշվարկվել է OPUS-ի (Bruker) միջոցով՝ օգտագործելով ինը միավորի հարթեցման միջակայքը:Սպեկտրները նորմալացվել են 1720-ից 1580 սմ-1-ի միջև ընկած նույն ինտեգրացիոն շրջանում՝ օգտագործելով F. Menges «Spectragryph – Optical Spectroscopy Software»:ATR-IR սպեկտրոսկոպիայում ինֆրակարմիր ճառագայթի ներթափանցման խորությունը նմուշ կախված է ալիքի թվից, ինչը հանգեցնում է ավելի ուժեղ կլանման ավելի ցածր ալիքային համարներում, քան ավելի բարձր ալիքային համարներում:Այս ազդեցությունները չեն շտկվել Նկ.-ում ներկայացված սպեկտրների համար:3, քանի որ դրանք շատ փոքր են (Լրացուցիչ նկար 4):Այս ցուցանիշի համար շտկված սպեկտրները հաշվարկվել են Bruker OPUS ծրագրաշարի միջոցով:
Սկզբունքորեն, սպիտակուցային կոնֆորմացիաների համապարփակ քանակական գնահատում հնարավոր է ամիդի I գագաթնակետում բաղադրիչների հուսալի ապակոնվոլյուցիայից հետո:Այնուամենայնիվ, գործնականում որոշ խոչընդոտներ են առաջանում.Սպեկտրում աղմուկը կարող է առաջանալ որպես (կեղծ) գագաթներ ապակոնվոլյուցիայի ժամանակ:Բացի այդ, ջրի ճկման պատճառով գագաթնակետը համընկնում է ամիդի I գագաթի դիրքի հետ և կարող է ունենալ նմանատիպ մեծություն մեծ քանակությամբ ջուր պարունակող նմուշների համար, ինչպիսին է այստեղ ուսումնասիրված ջրային գելը:Հետևաբար, մենք չփորձեցինք ամբողջությամբ քայքայել ամիդի I գագաթը, և մեր դիտարկումները պետք է դիտարկվեն միայն ի աջակցություն այլ մեթոդների, ինչպիսիք են NMR սպեկտրոսկոպիան:
50 մգ/մլ NT-ի և His-NT2RepCT-ի լուծույթները ժել են մեկ գիշերվա ընթացքում 37°C-ում:Այնուհետև հիդրոգելը նոսրացրել են 20 մՄ Տրիս-HCl-ով (pH 8) մինչև 12,5 մգ/մլ կոնցենտրացիա, լավ թափահարել և խողովակներով գելը կոտրել:Այնուհետև հիդրոգելը 10 անգամ նոսրացրել են 20 մՄ տրիս-HCl-ով (pH 8), նմուշի 5 մկլ քսել են ֆորմվարով պատված պղնձե ցանցի վրա, իսկ նմուշի ավելցուկը հանվել է բլոթեր թղթով:Նմուշները երկու անգամ լվացվեցին 5 մկլ MilliQ ջրով և ներկվեցին 1% ուրանի ֆորմատով 5 րոպե:Հեռացրեք ավելորդ բիծը ներծծող թղթով, ապա չորացրեք ցանցը օդով:Պատկերումն իրականացվել է այս ցանցերի վրա՝ օգտագործելով FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN, որն աշխատում է 100 կՎ լարման վրա:Պատկերները ձայնագրվել են x 26,500 և x 43,000 խոշորացումներով Veleta 2k × 2k CCD տեսախցիկով (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Գերմանիա):Յուրաքանչյուր նմուշի համար (n = 1) արձանագրվել է 10-15 պատկեր:ImageJ (https://imagej.nih.gov/) օգտագործվել է պատկերի վերլուծության և մանրաթելերի տրամագծերի չափման համար (n = 100, տարբեր մանրաթելեր):Պրիզմա 9-ն օգտագործվել է չզույգված t-թեստերի կատարման համար (երկապոչ):Միջին His-NT2RepCT և NT մանրաթելերը համապատասխանաբար եղել են 11,43 (SD 2,035) և 7,67 (SD 1,389) նմ:Վստահության միջակայքը (95%) -4.246-ից -3.275 է:ազատության աստիճաններ = 198, p <0,0001:
10 μM թիոֆլավին T (ThT) պարունակող 80 մկլ հեղուկ նմուշները չափվել են եռակի (n = 3) ստատիկ պայմաններում՝ օգտագործելով Corning 96 ջրհորի սև ներքևի մաքուր հատակի թիթեղները (Corning Glass 3881, ԱՄՆ):Ֆլյուորեսցենտային տարբերությունները գրանցվել են 440 նմ գրգռման ֆիլտրի և 480 նմ արտանետման ֆիլտրի միջոցով (FLUOStar Galaxy BMG Labtech, Offenburg, Գերմանիա):ThT ազդանշանը ոչ հագեցած էր, ոչ էլ հանգցված, քանի որ ThT-ի տարբեր կոնցենտրացիաներով փորձեր էին կատարվում՝ առանց ազդանշանի ինտենսիվությունը փոխելու:Արձանագրեք կլանումը 360 նմ մշուշի չափման համար:Սերմնավորման փորձերի համար 100 մգ/մլ գելեր են ձևավորվել 37°C-ում, նորից կասեցվել և օգտագործվել 5%, 10% և 20% մոլային հարաբերակցությամբ ցանելու համար:Տվյալները վերլուծվել են Prism 9-ի միջոցով:
Հալեցրեք His-NT2RepCT-ի և NT-ի պաշարները >100 մգ/մլ սառույցի վրա և զտեք 0,22 մկմ ֆիլտրով:Կոնցենտրացիաները հաշվարկվել են 280 նմ ներծծման չափման միջոցով Nanodrop-ի միջոցով:Պարզ հատակով 96 ջրհորանոց սև, չկապող ափսեի (Կորնինգ) հորերում նմուշները նոսրացրել են մինչև 20 մգ/մլ 20 մՄ տրիս-HCl pH 8-ում և խառնել 5 մկՄ ThT-ի հետ (վերջնական կոնցենտրացիան), նմուշի ընդհանուր կոնցենտրացիան: 50 մլ ծավալ:Նմուշները նկարահանվել են յուրաքանչյուր 10 րոպեն մեկ 37 °C ջերմաստիճանում CellObserver (Zeiss) մանրադիտակով` փոխանցվող լույսի ալիքով և FITC գրգռման և արտանետումների զտիչների հավաքածուներով ThT պատկերման համար:Պատկերման համար օգտագործվում է 20x/0.4 ոսպնյակ:Պատկերի վերլուծության համար օգտագործվել են Zen Blue (Zeiss) և ImageJ (https://imagej.nih.gov/):Գելեր են պատրաստվել նաև NT և His-NT2RepCT լուծույթներից 50 մգ/մլ կոնցենտրացիայում, որը պարունակում է 20 մՄ Tris pH 8 և 5 μM ThT և ինկուբացվել 37°C-ում 90 րոպե:Գելի կտորները տեղափոխվեցին նոր ջրհոր, որը պարունակում էր 20 մՄ Տրիս, pH 8 և 5 մկՄ ThT ոչ կապող սև 96 հորատանցքի թափանցիկ հատակի ափսեի մեջ:Ձեռք բերեք կանաչ ֆլուորեսցենտային և պայծառ դաշտի պատկերներ 20x/0,4 խոշորացմամբ:ImageJ-ն օգտագործվել է պատկերների վերլուծության համար:
Լուծման NMR սպեկտրները ստացվել են 310 K-ում 600 ՄՀց Bruker Avance Neo սպեկտրոմետրի վրա, որը հագեցած է QCI քառաբևեռ ռեզոնանսային իմպուլսային գրադիենտ դաշտային կրիոպրոբիով (HFCN):NMR նմուշներ, որոնք պարունակում են 10 մգ/մլ միատարր սպիտակուց՝ պիտակավորված 13C, 15N-ով, լուծված 20 մՄ տրիս-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .NT2RepCT-ի քիմիական տեղաշարժերը pH 6.7-ում օգտագործվել են 23-րդ գագաթնակետը նշանակելու համար 15N-HSQC-ի 2D սպեկտրում:
Կախարդական անկյան տակ պտտվող պինդ NMR (MAS) 13C, 15N պիտակավորված հիդրոգելների սպեկտրները գրանցվել են 800 ՄՀց հաճախականությամբ Bruker Avance III HD սպեկտրոմետրի վրա, որը հագեցած է 3,2 մմ 13C/15N{1H} առանց էլեկտրոնային զոնդով:Նմուշի ջերմաստիճանը վերահսկվել է գազի հոսքի փոփոխական ջերմաստիճանի միջոցով 277 Կ: Երկչափ դիպոլային ռոտացիոն ռեզոնանսային (DARR)76 և ռադիոհաճախականության վերամիացման (RFDR)77 սպեկտրները ձեռք են բերվել համապատասխանաբար 12,5 կՀց և 20 կՀց MAS հաճախականություններում:Խաչաձև բևեռացում (CP) 1H-ից մինչև 13C իրականացվել է 60,0-ից 48,0 կՀց հաճախականությամբ գծային թեքահարթակի միջոցով 1H-ում, 61,3/71,6 կՀց-ում 13C-ում (12,5/20 կՀց MAS-ում) և շփման ժամանակը՝ 0,5-1 ms:Տվյալների հավաքագրման ժամանակ օգտագործվել է Spinal6478 անջատում 73,5 կՀց հաճախականությամբ:Ձեռքբերման ժամանակը 10 միլիվայրկյան էր, իսկ ցիկլի ուշացումը՝ 2,5 վայրկյան:RFDR սպեկտրներում նկատված մեկ կապակցված Ca/Cβ հարաբերակցությունները նշանակվել են մնացորդային տիպի բնորոշ քիմիական տեղաշարժերի և DARR սպեկտրներում բազմակի կապակցված հարաբերակցությունների հիման վրա:
Zipper79 տվյալների բազան (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) օգտագործվել է NT-ի, NTFlSp-ի և NTMiSp-ի համար տատանումների միտումները և Rosetta-ի էներգիան գնահատելու համար:Zipper տվյալների բազան հաշվարկում է Rosetta Energy80-ը, որը միավորում է մի քանի անվճար էներգիայի ֆունկցիաներ՝ մոդելավորելու և վերլուծելու սպիտակուցի կառուցվածքը:-23 կկալ/մոլ կամ ավելի ցածր էներգիայի մակարդակը ցույց է տալիս ֆիբրիլացիայի բարձր միտում:Ցածր էներգիան նշանակում է երկու β-շղթաների ավելի կայունություն կայծակաճարմանդ կառուցվածքում:Բացի այդ, Վալսի ալգորիթմը օգտագործվել է NT, NTFlSp և NTMiSp ամիլոիդոգեն շրջանները կանխատեսելու համար։81. (https://waltz.switchlab.org/):
NT սպիտակուցի լուծույթը խառնվել է 2-(N-մորֆոլինո)էթանսուլֆոնիկ թթվի (MES) բուֆերի հետ pH 5.5 և 6.0 pH-ն իջեցնելու համար համապատասխանաբար մինչև pH 6 և 7:Սպիտակուցի վերջնական կոնցենտրացիան 100 մգ/մլ էր:
Չափումները կատարվել են J-1500 CD սպեկտրոմետրի վրա (JASCO, ԱՄՆ)՝ օգտագործելով 300 μL կուվետ՝ 0,1 սմ օպտիկական ճանապարհով:Սպիտակուցները նոսրացվել են մինչև 10 մկմ (n = 1) 20 մՄ ֆոսֆատային բուֆերում (pH 8):Աղի առկայության դեպքում սպիտակուցի կայունությունը վերլուծելու համար սպիտակուցները վերլուծվել են նույն կոնցենտրացիայով (n = 1) 20 մՄ ֆոսֆատային բուֆերում (pH 8), որը պարունակում է համապատասխանաբար 154 մՄ NaF կամ NaCl:Ջերմաստիճանի սկանավորումները գրանցվել են 222 նմ 25°C-ից մինչև 95°C՝ 1°C/րոպե տաքացման արագությամբ:Բնականաբար ծալված սպիտակուցների համամասնությունը հաշվարկվել է բանաձևով (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal):Բացի այդ, յուրաքանչյուր նմուշի համար արձանագրվել է հինգ սպեկտր՝ 260 նմ-ից մինչև 190 նմ 25°C-ում և մինչև 95°C տաքացումից հետո:Հինգ սպեկտրները միջինացվել են, հարթվել և վերածվել մոլային էլիպտիկության:Տվյալները վերլուծվել են Prism 9-ի միջոցով:
His-NT-GFP-ի ֆլուորեսցենտային ինտենսիվությունը (300 մգ/մլ, 80 µL) չափվել է եռակի (n = 3) 96 հորատանցք ունեցող Corning թիթեղներով՝ սև թափանցիկ հատակով (Corning Glass 3881, ԱՄՆ) ստատիկ պայմաններում:Չափել նմուշները 395 նմ գրգռման ալիքի երկարությամբ ֆլյուորեսցենտային հիմքով ափսեի ընթերցիչով և գրանցել արտանետումը 509 նմ-ում մինչև ժելացումը և 2 ժամ հետո 37°C ջերմաստիճանում:Տվյալները վերլուծվել են Prism 9-ով:
Պուրինի նուկլեոզիդ ֆոսֆորիլազի ակտիվության վերլուծության հավաքածուն (ֆտորաչափական մեթոդ, Sigma Aldrich) օգտագործվել է արտադրողի ցուցումների համաձայն:His-NT-PNP պարունակող գելերում և լուծույթներում ակտիվությունը չափելու համար խառնեք 10 նգ His-NT-PNP 100 մգ/մլ NT-ի հետ մինչև 2 մկլ ընդհանուր ծավալը, քանի որ գելը ազդանշան է տվել հավաքածուի հայտնաբերման միջակայքից բարձր:Ներառված էին գելերի և առանց His-NT-PNP լուծույթների հսկիչները:Չափումները կատարվել են երկու անգամ (n = 2):Ակտիվությունը չափելուց հետո ռեակցիայի խառնուրդը հեռացվեց և գելը լուսանկարվեց՝ ապահովելու համար, որ գելը անփոփոխ մնաց չափման ընթացքում:Տվյալները վերլուծվել են Prism 9-ի միջոցով:
Ուսումնասիրության նախագծման վերաբերյալ լրացուցիչ տեղեկությունների համար տե՛ս այս հոդվածին կից Բնության ուսումնասիրության ամփոփագիրը:
1-ին և 2-րդ նկարները ներկայացնում են նախնական տվյալները:1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, and 6, Լրացուցիչ նկ.3, լրացուցիչ նկ.5a, d, լրացուցիչ նկ.6 և լրացուցիչ նկ.8. Տվյալներ Այս հետազոտության տվյալները պահվում են Zenodo տվյալների բազայում https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653:Այս ուսումնասիրության արդյունքում ստացված NMR տվյալները տեղադրվել են BMRBig պահեստում՝ bmrbig36 մուտքի ID-ի ներքո:GFP-ի և PNP-ի կառուցվածքները վերցվել են PDB-ից (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2):
Rising, A. and Johansson, J. Spinning արհեստական սարդի մետաքս:Ազգային Քիմիական.Կենսաբանություն.11, 309–315 (2015):
Babb, PL et al.Nephila clavipes գենոմը ընդգծում է սարդի մետաքսի գեների բազմազանությունը և դրանց բարդ արտահայտությունը:Ազգային Ժենետ.49, 895–903 (2017):
Հրապարակման ժամանակը՝ Մար-12-2023