ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Դուպլեքս եռակցված խողովակ քիմիական արդյունաբերության քիմիական բաղադրիչի համար, SPECC1L-ի անբավարարությունը հանգեցնում է զուգված հոդերի կայունության բարձրացման և գանգուղեղային նյարդային բջիջների թափվելու նվազեցմանը:

Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար:Դուք օգտագործում եք զննարկչի տարբերակ՝ CSS-ի սահմանափակ աջակցությամբ:Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել Համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում):Բացի այդ, շարունակական աջակցություն ապահովելու համար մենք կայքը ցուցադրում ենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Դուպլեքս եռակցված խողովակ քիմիական արդյունաբերության համար

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.առաջատար արտադրող է, որը մասնագիտացած է չժանգոտվող պողպատից անխափան խողովակների, վառ եռացված խողովակների, անխափան կծկված խողովակների և այլնի մեջ:Հաճախորդներին հեշտացնելու համար մենք նաև եռակցում ենք խողովակներ և խողովակներ:Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ունի ամենաառաջադեմ արտադրական և փորձարկման սարքավորումները:Մենք կարող ենք լիովին բավարարել ձեր պահանջը:Շատ խիստ ստանդարտի համաձայն, մեր կողմից արտադրվող խողովակները միշտ ունեն ճիշտ OD և WT հանդուրժողականություն:Հանդուրժողականության հսկողությունը խստորեն համապատասխանում է ստանդարտներին:Մեր արտադրանքը միշտ գոհ է հաճախորդներից:Հաճախորդները ձեռք բերեցին մեր արտադրանքը, ավելի շատ շահույթ ստացան:
ա) OD (արտաքին տրամագիծ)՝ 3.18 մմ-ից 101.6 մմ
բ) WT (պատի հաստություն)՝ 0,5 մմ-ից 20 մմ
գ) երկարությունը՝ ըստ հաճախորդի պահանջի
դ) Ստանդարտներ. ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 և այլն
ե) Գործընթացի մեթոդ. ERW, EFW և այլն

Սլայդերներ, որոնք ցույց են տալիս երեք հոդված յուրաքանչյուր սլայդում:Օգտագործեք հետևի և հաջորդ կոճակները՝ սլայդների միջով շարժվելու համար, կամ սլայդ կարգավորիչի կոճակները վերջում՝ յուրաքանչյուր սլայդով շարժվելու համար:
Գանգի նեյրոնային գագաթի բջիջները (CNCC) դուրս են մղվում սաղմնային նյարդային ծալքերից և գաղթում դեպի ֆարինգիալ կամարները, որոնք կազմում են միջին դեմքի կառուցվածքների մեծ մասը:CNCC դիսֆունկցիան կարևոր դեր է խաղում բերան-դեմքի ճեղքվածքի էթիոլոգիայում, որը սովորական բնածին արատ է:Հետերոզիգոտ SPECC1L մուտացիաներ են հայտնաբերվել ատիպիկ և սինդրոմային ճեղքերով հիվանդների մոտ:Այստեղ մենք զեկուցում ենք կանոնական սոսինձային հանգույցի (AJ) բաղադրիչների, β-կատենինի և E-cadherin-ի ուժեղացված գունավորում մշակված SPECC1L նոկդաունի բջիջներում, իսկ էլեկտրոնային միկրոգրաֆները ցույց են տալիս AJ-ի գագաթային-բազալ դիֆուզիոն:SPECC1L-ի դերը գանգուղեղային մորֆոգենեզում հասկանալու համար մենք ստեղծեցինք Specc1l-ի անբավարար մկնիկի մոդել:Հոմոզիգոտ մուտանտները սաղմնային մահացու են և դրսևորում են նյարդային խողովակի փակման և CNCC շերտավորման խանգարումներ:AJ սպիտակուցի ներկումը մեծանում է մուտանտ նյարդային ծալքերում:Այս AJ թերությունը համապատասխանում է CNCC շերտազատման թերությանը, որը պահանջում է AJ-ի տարրալուծում:Բացի այդ, Specc11 մուտանտները նվազեցրել են PI3K-AKT ազդանշանը և ավելացրել են ապոպտոզը:In vitro, PI3K-AKT ազդանշանային մեղմ արգելակումը վայրի տիպի բջիջներում բավարար էր AJ փոփոխություններ առաջացնելու համար:Կարևորն այն է, որ SPECC1L նոկդաունի հետևանքով առաջացած AJ փոփոխությունները կարող են շրջվել PI3K-AKT ուղու ակտիվացմամբ:Այս տվյալները միասին ենթադրում են, որ SPECC1L-ը, որպես PI3K-AKT ազդանշանային և AJ կենսաբանության նոր կարգավորիչ, անհրաժեշտ է նյարդային խողովակի փակման և CNCC շերտավորման համար:
Գանգուղեղային նեյրոնային բջիջները (CNCCs) տեղայնացվում են մեջքային նեյրոէկտոդերմայում և անջատվում զարգացող նեյրոնային ծալքերի նեյրոէպիթելից՝ էպիթելային-մեզենխիմալ անցումը (EMT) 1,2,3 ներառող գործընթացի միջոցով:Պրեմիգրացիոն էպիթելային CNCC-ները խախտում են միջբջջային հանգույցները և վերածվում են միգրացիոն մեզենխիմալ CNCC-ների, որոնք լրացնում են առաջին և երկրորդ ֆարինգիալ կամարները և կազմում գանգուղեղային աճառի մեծ մասը:Այսպիսով, CNCC-ի գործառույթը կարգավորող գեները հաճախ խաթարվում են գանգուղեղային բնածին անոմալիաների էթիոլոգիայում, ինչպիսիք են բերան-դեմքի ճեղքերը, որոնք առավել հաճախ ազդում են միայն ԱՄՆ-ում 1/800 ծնունդների վրա:Բնածին դեֆորմացիաներից մեկը8.
CNCC-ի շերտազատումը համընկնում է մկների սաղմնային զարգացման 8,5-ից 9,5 օրվա ընթացքում առաջի նյարդային խողովակի փակման հետ:Մկների բերան-դեմքի ճեղքվածքի հետ կապված մի շարք գեների մուտանտները նույնպես դրսևորում են նյարդային խողովակի արատների որևէ ձև, ներառյալ Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 և Pdgfrα12:Այնուամենայնիվ, նյարդային խողովակի փակման և CNCC շերտավորման գործընթացները կարելի է համարել անկախ, քանի որ Splotch մուտանտ մկնիկը (Pax3) ցուցադրում է նյարդային խողովակի փակման թերություններ՝ առանց որևէ ազդեցության CNCC շերտավորման կամ միգրացիայի վրա 13,14:Մկնիկի հավելյալ մոդելները CNCC մասնահատման և նյարդային խողովակի փակման թերություններով կօգնեն ուրվագծել այս երկու գործընթացների ընդհանուր մոլեկուլային հիմքը:
Նեյրոէպիթելային բջիջներից CNCC-ի մեկուսացումը պահանջում է կպչուն հանգույցների (AJs) լուծարում, որոնք կազմված են սպիտակուցային կոմպլեքսներից, որոնք պարունակում են, ի թիվս այլոց, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin և α-actinin, որոնք կապված են ակտինի թելերի հետ 2: Գերարտահայտման ուսումնասիրությունները Նյարդային ծալքերում E-cadherin-ը ցույց է տվել CNCC շերտազատման նվազում կամ ուշացում:Եվ հակառակը, E-cadherin-ի ճնշումը հանգեցնում է վաղ շերտավորման15,16:CNCC շերտավորման ժամանակ EMT-ին միջնորդող գործոններից շատերը տրանսկրիպցիոն գործոններն են (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) և արտաբջջային մատրիցով (ECM) վերափոխող սպիտակուցները, ինչպիսիք են մատրիցային մետաղապրոտեինազները (MMPs), սակայն CNCC-ները ուղղակի ցիտոկարգավորիչներ են: դեռ հայտնի չէ:Հայտնի է, որ PI3K-AKT ուղին հակադրում է E-cadherin մակարդակները, հիմնականում քաղցկեղի հետազոտության արդյունքում17:Վերջին ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ PDGFα-ի վրա հիմնված PI3K-AKT ազդանշանի կորուստը մկների մոտ հանգեցնում է գանգուղեղային անոմալիաների, ներառյալ քիմքի ճեղքվածքը և նյարդային խողովակի արատները12:Այնուամենայնիվ, PI3K-AKT ուղու և AJ կայունության միջև կապը CNCC շերտավորման վրա պարզ չէ:
Մենք նախկինում նույնացրել էինք SPECC1L-ը որպես առաջին մուտանտի գենը երկու մարդկանց մոտ, որոնք ունեն ծանր ճեղքվածք, որը տարածվում է բերանից մինչև աչք, որը հայտնի է որպես թեք ճեղք (ObFC) կամ Tessier IV18 ճեղքվածք:SPECC1L մուտացիաները հայտնաբերվել են երկու բազմասերունդ ընտանիքներում՝ աուտոսոմային գերիշխող Opitz G/BBB սինդրոմով (OMIM #145410), որտեղ ախտահարված անհատները դրսևորել են հիպերհեռավորություն և շրթունք/ճեղք19, և մեկ ընտանիքում՝ Tibi գերհեռավորության համախտանիշով (OM42014) .Opitz G/BBB համախտանիշի դեպքերի կեսից ավելին X-կապակցված է (OMIM #300000) և առաջանում է MID1 գենի մուտացիաներով, որը կոդավորում է միկրոխողովակներով կապված բջջային կմախքի սպիտակուցը 22-ը:Մենք ենթադրում ենք, որ SPECC1L-ը, որը նաև մի սպիտակուց է, որը կապված է միկրոխողովակների և ակտինի ցիտոկմախքի հետ, կարող է միջնորդել ակտինի ցիտոկմախքի վերափոխման համար անհրաժեշտ ազդանշանը բջիջների կպչման և միգրացիայի ժամանակ 18:In vitro և in vivo ուսումնասիրությունների միջոցով մենք այժմ նկարագրում ենք SPECC1L-ը որպես AJ-ի կայունության նոր կարգավորիչ PI3K-AKT ազդանշանի միջոցով:Բջջային մակարդակում SPECC1L-ի անբավարարությունը հանգեցրեց pan-AKT սպիտակուցի մակարդակի նվազմանը և AJ-ի գագաթային-բազային դիսպերսիայի ավելացմանը, որը վերացավ AKT ուղու քիմիական ակտիվացմամբ:In vivo-ում, Specc11-ի պակաս ունեցող սաղմերը ցույց են տալիս նյարդային խողովակի փակման խանգարում և CNCC-ի կրճատված դիսեկցիա:Այսպիսով, SPECC1L-ը գործում է բարձր կարգավորվող բջջային կպչունության վրա հիմնված ազդանշանում, որն անհրաժեշտ է դեմքի մորֆոգենեզի ընթացքում նորմալ CNCC ֆունկցիայի համար:
Բջջային մակարդակում SPECC1L-ի դերը բնութագրելու համար մենք օգտագործեցինք նախկինում նկարագրված կայուն օստեոսարկոմայի բջջային գիծը, որը պակասում է SPECC1L18-ում:Այս կայուն U2OS բջիջները SPECC1L (kd) նոկդաունով ունեցել են SPECC1L տառադարձումների և սպիտակուցների մակարդակների չափավոր (60–70%) նվազում, ինչպես նաև ակտինի ցիտոկմախքի միգրացիայի և վերակազմակերպման արատներ 18: Ի հակադրություն, կտրուկ անցողիկ նվազում Ապացուցված է, որ SPECC1L-ը հանգեցնում է միտոտիկ արատների 23:Հետագա բնութագրումից հետո մենք պարզեցինք, որ մեր կայուն SPECC1L-kd բջիջները փոխեցին մորֆոլոգիան միաձուլման շատ բարձր աստիճանով (Նկար 1):Առանձին հսկիչ բջիջները և kd բջիջները ցածր միախառնման վայրում նման տեսք ունեին (Նկար 1A,D):Միաձուլումից 24 ժամ անց հսկիչ բջիջները պահպանեցին իրենց խորանարդաձև ձևը (նկ. 1B, E), մինչդեռ SPECC1L-kd բջիջները երկարացան (նկ. 1C, F):Բջջի ձևի այս փոփոխության չափը ֆիքսվել է հսկիչ բջիջների և kd բջիջների in vivo կենդանի պատկերման միջոցով (ֆիլմ 1):SPECC1L-ի դերը միաձուլվող բջիջներում որոշելու համար մենք նախ ուսումնասիրեցինք դրա արտահայտությունը:Մենք գտանք, որ SPECC1L սպիտակուցի մակարդակն ավելացել է միաձուլման ժամանակ (Նկար 1G), մինչդեռ SPECC1L տառադարձման մակարդակները չեն աճել (Նկար 1H):Բացի այդ, երբ բջիջների խտությունը մեծանում էր, SPECC1L սպիտակուցը կուտակվում էր միջբջջային սահմաններում (նկ. 2A-E), որի օրինաչափությունը համընկնում է մեմբրանի հետ կապված β-catenin-ի հետ (նկ. 2A'-E'):Հաշվի առնելով SPECC1L-ի կապը ակտինի ցիտոկմախքի հետ 18,23, մենք ենթադրեցինք, որ SPECC1L-ը փոխազդում է ակտինի վրա հիմնված կպչուն հանգույցների (AJ) հետ:
(AF) SPECC1L նոկդաունի (DF) բջիջները երկարանում են բարձր միախառնման (F) ժամանակ՝ համեմատած վերահսկվող U2OS բջիջների (AC):Այստեղ ցուցադրված են վեց ժամանակային կետերից երեքը (T1, T3, T6), որոնք մենք ընտրել ենք տարբեր բջիջների խտության համար:(G) Western blot վերլուծություն, որը ցույց է տալիս, որ SPECC1L սպիտակուցը կայունացել է միաձուլման բարձր աստիճանում՝ համեմատած հսկիչ բջիջներում միախառնման ցածր աստիճանի հետ:SPECC1L-ի Western blot-ը ցույց է տալիս ակնկալվող 120 կԴա գոտին և ավելի բարձր մոլեկուլային քաշի գոտին, որը հնարավոր է հետթարգմանական ձևափոխված (*):Վեստերն բլոտի անալիզը կատարվել է նույն պայմաններում ցածր և բարձր միախառնման դեպքում:Պատկերները, որոնք ցույց են տալիս SPECC1L-ը ցածր և բարձր միախառնման ժամանակ, վերցվել են նույն բծերից:Նույն բլոտը հանվել է և կրկին հետազոտվել β-ակտին հակամարմինով:(H) Քանակական RT-PCR վերլուծությունը ցույց չի տվել SPECC1L տառադարձման մակարդակներում էական փոփոխություններ:Սխալների գծերը ներկայացնում են SEMs չորս անկախ փորձերից:
(AE) Մենք ընտրեցինք վեց ժամանակային կետեր (T1-T6), որոնք ներկայացնում են բջիջների խտությունների մի շարք՝ բջիջների ձևի վերլուծությունը և AJ փոփոխությունները U2OS բջիջներում SPECC1L նոկդաունով (kd) նորմալացնելու համար:Այս ժամանակային կետերից առաջին հինգը ներառում էին միայնակ բջիջներ (T1), փոքր բջիջների կլաստերների 50-70% միաձուլում (T2), միաձուլում առանց kd բջիջների վերակազմավորման (T3), kd բջիջների ձևափոխում (T4) և 24 ժամյա փոփոխություններ:kd (T5) բջիջների հետին ձևով:SPECC1L սպիտակուցը հիմնականում ցրվել է ցիտոպլազմայում T1 (A) կետում, սակայն դրա կուտակումը նկատվել է միջբջջային սահմաններում հետագա ժամանակային կետերում (B–E, սլաքներ):(FJ) β-catenin-ը ցույց է տալիս նմանատիպ կուտակում միջբջջային սահմաններում, որոնք կապված են AJ համալիրի հետ:(A'-E') SPECC1L-ը և β-catenin-ը ցույց են տալիս համընկնող գունավորում բջիջների սահմաններում բջիջների բարձր խտությամբ (սլաքներ):(F'-J') SPECC1L-kd բջիջներում β-կատենինի ներկումը նորմալ է թվում բջիջների ցածր խտության դեպքում (F'-H'), բայց ընդլայնվում է բջջի ձևի փոփոխության հետ (I', J'; սլաքներ), ինչը ցույց է տալիս, որ AJ փոխվել են.Ձողեր = 10 մկմ:
Այնուհետև մենք փորձեցինք որոշել SPECC1L-ի անբավարարության ազդեցությունը AJ-ի վրա:Մենք օգտագործեցինք AJ-ի հետ կապված մի քանի մարկերներ, ներառյալ կանոնական բաղադրիչները F-actin, myosin IIb, β-catenin և E-cadherin24,25,26,27:Ակտինի սթրեսային մանրաթելերն ավելացել են SPECC1L-kd բջիջներում, ինչպես նկարագրված է նախկինում (Նկար 3A,B) 18:Ակտինի թելերի հետ կապված Myosin IIb-ը ցույց է տվել SPECC1L-kd բջիջների համանման աճ in vitro (նկ. 3C,D):AJ-ի հետ կապված β-catenin-ը կապվում է կադերինին բջջային թաղանթում՝ ցույց տալով նորմալ «մեղրախորիսխ» արտահայտման օրինաչափություն վերահսկող խորանարդ բջիջներում (նկ. 3E,G):Հետաքրքիր է, որ համաֆոկալ մանրադիտակի օգտագործմամբ հարթ պատկերներում β-կատենինը (Նկար 3E,F) և E-cadherin (Նկար 3G,H) ներկված SPECC1L-ի պակաս ունեցող բջիջների բջջային թաղանթի վրա ցույց տվեցին երկարաձգված ներկման ընդգծված օրինաչափություններ:AJ-ի հետ կապված β-կատենինի ներկման այս ընդլայնումը kd բջիջներում առավել ցայտուն էր միաձուլման ժամանակ, բայց կարծես նախորդում էր բջիջների ձևի փոփոխություններին (նկ. 2F-J, F'-J'):Այս ընդլայնված AJ ներկման ֆիզիկական բնույթը որոշելու համար մենք ուսումնասիրեցինք բջիջների սահմանները SPECC1L-kd U2OS բջիջների գագաթային-բազալ մակերեսի վրա՝ փոխանցման էլեկտրոնային մանրադիտակի միջոցով (TEM) (Նկար 3I,J):Ի տարբերություն հսկիչ բջիջների (նկ. 3I), որոնք ունեին AJ-ի (սլաքների) ցուցիչ առանձին էլեկտրոնային խիտ շրջաններ, kd բջիջները (Նկար 3J) ցույց տվեցին բարձր էլեկտրոնային խտության մեծ, հարակից շրջաններ, որոնք ցույց են տալիս AJ-ի ապիկոբազալ հարթության երկայնքով:.Բացի այդ, լայնակի հատվածների վրա մենք նկատեցինք լայնածավալ բջջային մեմբրանի ծալքեր kd բջիջներում (նկ. S1A, B), ինչը բացատրում է β-catenin և E-cadherin ներկման շերտերի ընդլայնված օրինակը (նկ. 3F, H):Ի պաշտպանություն SPECC1L-ի դերի AJ-ներում, β-catenin-ը SPECC1L-ի հետ համատեղ իմունային նստվածք է ստացել միաձուլվող U2OS բջիջների լիզատներում (նկ. 3K):AJ մարկերների ընդլայնված իմունային ներկման հետ մեկտեղ, TEM վերլուծությունը համահունչ էր մեր վարկածին, որ SPECC1L-ի անբավարարությունը մեծացնում է AJ-ի գագաթային-բազային խտությունը և շեղումը:
(AH) F-ակտինի ներկման ավելացում kd բջիջներում միաձուլումից 48 ժամ հետո (T6; A, B):F-ակտինի հետ կապված myosin IIb-ի փոփոխված գունավորում (C, D):Վերահսկիչ բջիջներում (E, G) β-catenin և E-cadherin թաղանթների ներկման սահուն օրինակը ուժեղացվել է SPECC1L-kd (F, H) բջիջներում:Ձողեր = 10 մկմ:(I–J) Էլեկտրոնային միկրոգրաֆներ, որոնք դիտարկում են գագաթային-բազալ միջբջջային հանգույցը:Վերահսկիչ բջիջները ցույց են տալիս հստակ էլեկտրոնային հատվածներ, որոնք ցույց են տալիս կպչուն միացումներ (I, սլաքներ):Ի հակադրություն, SPECC1L-kd բջիջներում ամբողջ գագաթային-բազալ հանգույցը երևացել է էլեկտրոնային խիտ (J, սլաքներ), ինչը ցույց է տալիս կպչուն միացումների խտության և ցրվածության բարձրացումը:(K) β-կատենինը SPECC1L-ի հետ համատեղ իմունային նստվածք է ստացել U2OS բջջային լիզատներում:Պատկերը վերցված է մեկ կետից, որը ներկայացնում է չորս անկախ փորձերից մեկը:
SPECC1L-ի դերը գանգուղեղային մորֆոգենեզում հասկանալու համար մենք ստեղծեցինք Spec1l-ի անբավարար մկնիկի մոդել՝ օգտագործելով երկու անկախ ES ծուղակ բջջային գծեր՝ DTM096 և RRH048 (BayGenomics, CA), որոնք ներկայացնում են ինտրոն 1 և Specc1l տառադարձումները, որոնք ֆիքսվել են 115-ում (նկ.) .4A, նկար S2):Կեղծ վեկտորի ներդիրի գենոմային տեղակայումը որոշվել է ամբողջ գենոմի հաջորդականությամբ և հաստատվել է PCR-ով (նկ. S2):Երկու գենային թակարդների ձևավորումները նաև թույլ են տվել Specc11-lacZ լրագրողների միաձուլումը կադրում գրավելիս:Հետևաբար, lacZ-ի արտահայտումը, որը որոշվել է X-gal ներկումով, օգտագործվել է որպես Specc11 արտահայտության ցուցիչ:Երկու ալելներն էլ ցույց են տվել lacZ-ի արտահայտման նման օրինաչափություններ, ընդ որում DTM096 գենային թակարդը ինտրոն 1-ում ցույց է տալիս ավելի ուժեղ արտահայտություն, քան RRH048-ը ինտրոն 15-ում (ցուցադրված չէ):Այնուամենայնիվ, Spec1l-ը լայնորեն արտահայտված է, հատկապես ուժեղ արտահայտությամբ նյարդային ծալքերում E8.5-ում (Նկար 4B), նյարդային խողովակում և դեմքի պրոցեսներում E9.5 և E10.5 (Նկար 4C,D) և զարգացող վերջույթներում: E10-ում:5 և աչքերը (Նկար 4D):Մենք նախկինում հայտնել էինք, որ SPECC1L արտահայտությունը E10.5-ում առաջին ֆարինգիալ կամարում առկա էր էպիթելում և հիմքում ընկած մեզենխիմում18, որը համապատասխանում էր CNCC տոհմին:CNCC-ում SPECC1L արտահայտությունը ստուգելու համար մենք կատարեցինք E8.5 նյարդային ծալքեր (Նկար 4E-J) և E9.5 գանգի հատվածներ (Նկար 4K-):E8.5-ում SPECC1L-ը ինտենսիվ ներկել է նյարդային ծալքերը (նկ. 4E, H), ներառյալ NCC մարկերներով ներկված բջիջները (նկ. 4G, J):E9.5-ում SPECC1L-ը (նկ. 4K, N) խիստ ներկված միգրացիոն CNCC-ի հետ համատեղ ներկված է AP2A-ով (նկ. 4L, M) կամ SOX10-ով (նկ. 4O, P):
(A) Մկնիկի Specc11 գենի սխեմատիկ ներկայացում, որը ցույց է տալիս խաբեության վեկտորի ներդրումը ES DTM096 (ինտրոն 1) և RRH048 (ինտրոն 15) բջջային կլոններում:(BD) lacZ ներկում հետերոզիգոտ Speccc1lDTM096 սաղմերի, որոնք ներկայացնում են Spec1l արտահայտությունը E8.5-ից մինչև E10.5:NE = նեյրոէկտոդերմա, NF = նյարդային ծալք, PA1 = առաջին ֆարինգիալ կամար:(EP) SPECC1L իմունային ներկում NCC մարկերներով AP2A և SOX10 E8.5 (NF; EJ) նյարդային ծալքերում և E9.5 (KP) գանգի հատվածներում:SPECC1L ներկումը լայնորեն նկատվել է E8.5 նեյրոնային ծալքերում (E, H; նետերի ծայրեր), ներառյալ AP2A (F, G; նետերի ծայրեր) և SOX10 (I, J; նետերի ծայրեր) պիտակավորված բջիջներում:E9.5-ում SPECC1L-ը խիստ ներկված միգրացիոն CNCC-ներ (K, N; սլաքներ) պիտակավորված AP2A (L, M; սլաքներ) և SOX10 (O, P; սլաքներ):
Հետերոզիգոտ Specc1lDTM096/+ և Specc1lRRH048/+ մկների միջև խաչմերուկը ցույց է տալիս, որ երկու գենային թակարդի ալելները փոխլրացնող չեն, և որ գենային թակարդի ալելների համար բաղադրյալ հետերոզիգոտներն ու սաղմնային հոմոզիգոտները սաղմնային մահացու են (Աղյուսակ S1):Մենդելյան գործակիցները ցույց են տվել ծննդյան ժամանակ հետերոզիգոտների գոյատևման մակարդակի նվազում (ակնկալվում է 1,34 ընդդեմ 2,0-ի):Մենք նկատեցինք ցածր պերինատալ մահացություն հետերոզիգոտների շրջանում, ոմանք ունեին գանգուղեղային անոմալիաներ (նկ. S3):Այնուամենայնիվ, այս պերինատալ գանգուղեղային ֆենոտիպերի ցածր թափանցելիությունը դժվարացնում է դրանց հիմքում ընկած պաթոֆիզիոլոգիական մեխանիզմների ուսումնասիրությունը:Հետևաբար, մենք կենտրոնացել ենք հոմոզիգոտ Specc11 մուտանտների սաղմնային մահացու ֆենոտիպի վրա:
Բաղադրյալ հետերոզիգոտ կամ հոմոզիգոտ Specc1lDTM096/RRH048 մուտանտ սաղմերը չեն զարգանում E9.5–10.5-ից հետո (նկ. 5A–D), իսկ նյարդային խողովակը չի փակվել առջևից (նկ. 5B, D) և երբեմն փակվել է հետևից (ցուցադրված չէ) ..Գանգուղեղային նյարդային խողովակի փակման այս թերությունը կապված էր CNCC նշանավորմամբ DLX2-ի մեծամասնության հետ, որը մնում էր նեյրոնային ծալքերում E10.5-ում, ինչը ցույց է տալիս ոչ մասնահատում (Նկար 5A'-D'):Որոշելու համար, թե արդյոք CNCC-ի ընդհանուր չափը նույնպես կրճատվել է, մենք CNCC գծերը նշել ենք GFP-ով մեր գենային թակարդի գծերում Wnt1-Cre-ով և ROSAmTmG-ով:Մենք ամբողջ սաղմերից տեսակավորել ենք GFP+ NCC և GFP- (RFP+) ոչ NCC:E9.5-ում հոսքով տեսակավորված GFP-ով պիտակավորված CNCC-ների մասնաբաժինը էականորեն չի փոխվել WT-ի և մուտանտի սաղմերի միջև (ցուցադրված չէ), ինչը ցույց է տալիս նորմալ CNCC ճշգրտումը:Հետևաբար, մենք ենթադրեցինք, որ մնացորդային Wnt1-Cre և DLX2 ներկումը բաց նեյրոնային ծալքերում (Նկար 5B') պայմանավորված է թերի CNCC շերտավորմամբ, հնարավոր է AJ բջիջների խտության կամ ցրման ավելացման պատճառով, ինչպես երևում է SPECC1L-kd բջիջներում:Մենք օգտագործեցինք SOX10, AP2A և DLX2 NCC մարկերները՝ հաստատելու CNCC-ի առկայությունը նյարդային ծալքում (Նկար 5E-R):E8.5-ում բոլոր երեք NCC մարկերների համար նկատվել է նյարդային ծալքի ներկում WT-ի (նկ. 5E, G, I) և Spec.1l մուտանտի (նկ. 5F, H, J) հատվածներում:E9.5-ում, մինչ NCC մարկերները ներկում էին միգրացիոն NCC-ը WT հատվածներում (նկ. 5M, O, Q), մնացորդային NCC ներկում նկատվեց Specc1l մուտանտ սաղմերի մերկացած նյարդային ծալքերում (նկ. 5N, P, R):Քանի որ SOX10-ը և DLX2-ը նշում են միգրացիոն CNCC-ները, այս արդյունքը ցույց է տալիս, որ SPECC1L-ի պակաս ունեցող CNCC-ները հասնում են հետմիգրացիոն սպեցիֆիկացիայի, բայց չեն կարողանում ներգաղթել նյարդային ծալքերից:
Specc11-ի անբավարարությունը հանգեցնում է նյարդային խողովակի թերի փակման, գանգուղեղային նեյրոնային գագաթի բջիջների և AJ-ների շերտազատմանը:
(A, B') E9.5 WT (A) Սաղմը, որը կրում է գաղթող գանգի նյարդային բջիջներ (CNCC) պիտակավորված Wnt1-Cre (A'):Ի հակադրություն, Specc11 մուտանտի սաղմերը ցույց են տալիս բաց նյարդային ծալքեր (B), նետերի ծայրեր և CNCC-ներ, որոնք չեն գաղթել (B', նետերի ծայրեր):(C, D') E10.5 WT սաղմերի (C, C') և Spec1l (D, D') CNCC մարկերի DLX2 (C, D') պայծառ դաշտի պատկերներ (C, D') և իմունային ներկում (C', D'):WT E10.5 սաղմերում DLX2-դրական CNCC-ը գաղութացնում է մաղձի կամարները (C', սլաքներ), մինչդեռ մուտանտների մոտ ակնհայտ երանգավորումը պահպանվում է բաց նյարդային ծալքերում (D', սլաքներ) և առաջին ֆարինգիալ կամարներում (D', սլաքներ):) որոշ գունավորումով (սլաքներ), որոնք ցույց են տալիս CNCC-ի վատ շերտազատումը և միգրացիան:ER) WT և Spec1l մուտանտ սաղմերի հատվածները E8.5 (E–L) և E9.5 (M–R) փուլերում պիտակավորված են NCC մարկերներով SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) և DLX2 (I, J, Q, R):E8.5-ում NCC ներկումը նկատվել է վայրի տիպի նյարդային ծալքի (NF) և մուտանտի հատվածներում:SOX10-ի և β-catenin-ի համատեղ ներկումը E8.5 WT-ում (K) և մուտանտի (L)-ում բացահայտեց բ-կատենինի ներկման ավելացում նյարդային ծալքերում բջիջների սահմաններում:E9.5-ում նկատվել է արտագաղթող CNCC-ների վայրի տիպի գունավորում (M, O, Q), մինչդեռ մուտանտների դեպքում չշերտավորված CNCC-ները ներկել են բաց նյարդային ծալքեր (N, P, R):(S–Z) In vivo AJ պիտակավորման վերլուծություն WT և Specc11DTM096/RRH048 սաղմերի կորոնային հատվածներում E9.5 մուտացիայով:Վերին աջ անկյունում ներկայացված է մոտավոր հատվածային հարթություն:Մուտանտ հյուսվածքների հատվածներում նկատվել է F-ակտինի (S, T) և myosin IIb-ի (U, V) ներկման ավելացում:Նկար 3-ում in vitro արդյունքների նման, մուտանտ սաղմերում, նկատվել է β-catenin (W, X) և E-cadherin (Y, Z) մեմբրանի ուժեղացված ներկում:(AA-BB) Վայրի տիպի սաղմի մի հատվածի էլեկտրոնային միկրոգրաֆը, որը նայում է գագաթային-բազային բջջի սահմանից այն կողմ, ցույց է տալիս հստակ էլեկտրոնային խիտ շրջան, որը ցույց է տալիս կպչուն միացումները (AA, սլաքներ):Ի հակադրություն, Specc11 մուտանտ սաղմերի հատվածներում (BB, սլաքներ) ամբողջ ապիկոբազալ հանգույցը էլեկտրոնային խիտ է, ինչը ցույց է տալիս կպչուն հանգույցների խտության և ցրվածության աճ:
Մեր վարկածը ստուգելու համար, որ կրճատված շերտավորումը պայմանավորված է փոփոխված AJ-ով, մենք ուսումնասիրեցինք AJ-ի պիտակավորումը Specc1l մուտանտ սաղմերի մերկացած նյարդային ծալքերում (նկ. 5S-Z):Մենք նկատեցինք ակտինային սթրեսային մանրաթելերի աճ (նկ. 5S, T) և ակտինի մանրաթելերի վրա միոզին IIB-ի ներկման միաժամանակյա աճի տեղայնացում (նկ. 5U, V):Կարևորն այն է, որ մենք նկատեցինք β-կատենինի (Նկար 5W,X) և E-cadherin-ի (նկ. 5Y,Z) ավելացած գունավորում միջբջջային սահմաններում:Մենք նաև ուսումնասիրեցինք NCC-ի β-կատենինի ներկումը E8.5 սաղմերի նյարդային ծալքերում (նկ. 5K, L):β-catenin ներկումը ավելի ուժեղ էր Specc1l մուտանտ նյարդային ծալքերում (նկ. 5L և K), ինչը ենթադրում է, որ AJ փոփոխությունները սկսվել են:E9.5 սաղմերի գանգի հատվածների էլեկտրոնային միկրոգրաֆիաներում մենք կրկին նկատեցինք Specc1l մուտանտի սաղմերի դիֆուզիոն էլեկտրոնային խիտ ներկման աճ՝ համեմատած WT-ի հետ (նկ. 5AA, BB և S1E-H):Միասին այս արդյունքները հաստատում են մեր in vitro արդյունքները SPECC1L-kd U2OS բջիջներում և ենթադրում են, որ շեղված AJ ներկումը նախորդում է CNCC շերտավորմանը մեր մուտանտ սաղմերում:
Հաշվի առնելով AKT-ի ակտիվության և E-cadherin կայունության միջև հայտնի անտագոնիստական ​​կապը, մենք ենթադրեցինք PI3K-AKT ազդանշանային ազդանշանի ներգրավվածությունը:Ի լրումն, մենք նկատեցինք ենթաէպիդերմային բշտիկներ մեր որոշ մուտանտ սաղմերում, որոնք խուսափել են մահաբերությունից (<5%) E9.5-10.5-ում և փոխարենը նստել մոտ E13.5 (նկ. S3):Ենթաէպիդերմալ վեզիկուլները PDGFRα12-ի վրա հիմնված նվազեցված PI3K-AKT ազդանշանային նշան են:Fantauzzo et al.(2014) հաղորդում է, որ PDGFRα-ի վրա հիմնված PI3K ակտիվացման խախտումը PdgfraPI3K/PI3K մուտանտ սաղմերում հանգեցնում է ենթաէպիդերմալ վեզիկուլների, նյարդային խողովակի արատների և ճեղքվածքի ֆենոտիպերի:Իրոք, pan-AKT-ի և ակտիվ ֆոսֆորիլացված Ser473-AKT-ի մակարդակները in vivo-ում նվազեցին Specc1l մուտանտի հյուսվածքներում մինչև E9.5 սաղմնային կանգ (նկ. 6A-D):Ֆոսֆորիլացված Ser473-AKT-ի մակարդակների նվազումը կարող է ամբողջությամբ պայմանավորված լինել pan-AKT-ի մակարդակների նվազմամբ in vivo (Նկար 6E) և in vitro (Նկար 6F):In vitro նվազում է նկատվել միայն այն ժամանակ, երբ U2OS բջիջները խիստ համահունչ են բջիջների ձևի և AJ խտության փոփոխություններին (Նկար 6D):Այսպիսով, մեր տվյալները ցույց են տալիս, որ SPECC1L-ը PI3K-AKT ազդանշանային նոր դրական կարգավորիչ է գանգուղեղային մորֆոգենեզում:
(A–E) E8.5 (A,B) և E9.5 (C,D) գանգի հատվածներ կամ E9.5 լիզատներ Speccc1l մուտանտ սաղմերից (E), որոնք ցույց են տալիս ակտիվ ֆոսֆորիլացված S473-AKT և pan-AKT սպիտակուցի նվազեցման մակարդակները։ , համեմատած հսկիչ WT-ի հետ:Western blotting-ը կատարվել է վայրի տիպի լիզատների և մուտանտային լիզատների վրա՝ նույն պայմաններում:SPECC1L-ի համար ցուցադրված պատկերները վերցված են մեկ բլոտից:Նույն բլոտը հանվել է և նորից հետազոտվել հակապան-ԱԿՏ և β-ակտին հակամարմիններով:Pan-AKT մակարդակները E8.5 նյարդային ծալքերում (A, B) և ֆոսֆորիլացված S473-AKT մակարդակները E9.5 գանգի հատվածներում զգալիորեն նվազել են:(F) Pan-AKT մակարդակները նմանապես կրճատվել են բարձր միախառնման ժամանակ հավաքված SPECC1L-kd U2OS բջիջների լիզատներում:Սխալների գծերը ներկայացնում են SEM-ներ երեք անկախ Western blot քանակականացումներից:(GJ) E9.5-ում WT սաղմերի հատվածները ներկված են համապատասխանաբար KI67-ով և ճեղքված կասպազով 3-ով, որոնք ցույց են տալիս բջիջների բազմացում (G, G') և փոքր ապոպտոտիկ ակտիվություն (H, H'):Specc11 մուտանտ սաղմերը ցույց են տալիս բջիջների համեմատելի բազմացում (I), սակայն ապոպտոզի ենթարկվող բջիջների թիվը զգալիորեն ավելացել է (J):
Այնուհետև մենք ուսումնասիրեցինք պրոլիֆերացիայի և ապոպտոզի մարկերները:Մենք որևէ տարբերություն չնկատեցինք E9.5 սաղմերի տարածման մեջ (նկ. 6E, G՝ համեմատած I-ի հետ) տարածման ինդեքսով 82.5% WT մուտանտների և 86.5% Specc1l մուտանտների համար, որոնք չափվում էին KI67 ներկումով (p <0.56, Fisher's: ճշգրիտ թեստ):Նմանապես, մենք չնկատեցինք որևէ տարբերություն ապոպտոզի մեջ, որը չափվում էր պառակտված կասպազ 3-ի համար նյարդային ծալքերում ներկելու միջոցով E8.5-ում մինչև սաղմի կանգը (ցուցադրված չէ) (ցուցված չէ):Ի հակադրություն, ապոպտոզը զգալիորեն ավելացել է բոլոր E9.5 մուտանտ սաղմերում (նկ. 6F, H և J):Ապոպտոզի այս ընդհանուր աճը համահունչ է PI3K-AKT ազդանշանի նվազեցմանը և վաղ սաղմնային մահացուությանը29,30,31:
Հաջորդը, PI3K-AKT ազդանշանի պատճառահետևանքային դերը հաստատելու համար մեր kd բջիջներում AJ փոփոխություններում, մենք քիմիապես փոխեցինք ուղին վերահսկողության և kd բջիջներում (Նկար 7A-F):Մենք որպես նշիչ օգտագործեցինք բջջի ձևի փոփոխության ֆենոտիպը, որը դիտվում էր միաձուլվող SPECC1L-kd բջիջներում, որը մենք քանակականացրեցինք՝ օգտագործելով ամենաերկար չափման (երկարության) և համապատասխան ուղղահայաց չափման (լայնության) հարաբերակցությունը:Համեմատաբար կլոր կամ խորանարդ բջիջների համար ակնկալվում է 1 հարաբերակցություն (Նկար 7G):Բջջի ձևից բացի, մենք նաև հաստատեցինք ազդեցությունը AJ-ի վրա β-catenin ներկման միջոցով (նկ. 7A'-F'):PI3K-AKT ճանապարհի արգելակումը, օգտագործելով wortmannin-ը, բավարար էր հսկիչ բջիջներում բջիջների ձևը փոխելու համար (Նկար 7A,C) և AJ (Նկար 7A'):PI3K-AKT ակտիվացնողը SC-79 չի ազդել բջիջների ձևի (Նկար 7A, E) կամ AJ-ի ընդլայնման (ՆԿ. 7A') հսկիչ բջիջներում:SPECC1L-kd բջիջներում PI3K-AKT ճանապարհի հետագա ճնշումը հանգեցրեց ապոպտոզի ավելացման (նկ. 7B, D) և β-կատենինի ներկման զգալի աճի (նկ. 7B'), որը համապատասխանում է մեր in vivo ծանր մուտանտներին:Կարևոր է, որ PI3K-AKT ճանապարհի ակտիվացումը զգալիորեն բարելավեց բջիջների ձևը (Նկար 7B,F) և AJ ֆենոտիպերը (Նկար 7B”):Բջջի ձևի փոփոխությունները քանակականացվել են որպես բջջի կլորության հարաբերակցություն (CCR) և համեմատվել են վերևում նկարագրված նշանակության համար (Նկար 7G):Իրոք, հսկիչ բջիջներում (նկ. 7G, CCR = 1,56), վորտմանինով բուժումը բավարար էր բջիջների ձևը զգալիորեն փոխելու համար (Նկար 7G, CCR = 3,61, p <2,4 × 10-9) այն չափով, որը նման էր դիտարկվածին: SPECC1L-ում:-kd բջիջներ (նկ. 7G, CCR = 3.46):SPECC1L-kd բջիջների վորտմանինի բուժումը (նկ. 7G, CCR = 3.60, աննշան) ավելի նշանակալի չէր, քան չմշակված kd բջիջները (նկ. 7G, CCR = 3.46, աննշան) կամ վորտմանինով մշակված հսկիչ բջիջները (նկ. 7G):, CCR = 3.46, աննշան) լրացուցիչ ազդում է բջիջների երկարացման վրա (7G, CCR = 3.61, աննշան):Ամենակարևորը, SC-79 AKT ակտիվացուցիչը վերականգնել է SPECC1L-kd բջիջների երկարացված ֆենոտիպը (նկ. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12):Այս արդյունքները հաստատում են, որ SPECC1L-ը կարգավորում է PI3K-AKT ազդանշանը և ենթադրում է, որ SPECC1L-ի չափավոր նվազումն ազդում է բջիջների կպչունության վրա, մինչդեռ ուժեղ նվազումը հանգեցնում է ապոպտոզի (նկ. 8):
(A–F') Վերահսկիչ (A, C, E) և SPECC1L-kd (B, D, F) բջիջներ, որոնք մշակվել են PI3K-AKT ճանապարհի արգելակիչով wortmannin (C, D) կամ SC-79 ակտիվացնող (E, F) բուժում .Չմշակված հսկիչ բջիջները խորանարդաձև են (A)՝ նորմալ β-cat բջջային ներկումով (A'), մինչդեռ kd բջիջները երկարաձգված են (B)՝ β-կատվի ներկման ավելացմամբ (B'):PI3K-AKT ուղու ճնշումից հետո հսկիչ բջիջները երկարացան (C) β-cat ընդլայնմամբ (C'), մինչդեռ kd բջիջները սկսեցին ենթարկվել ապոպտոզին (D), որը նման է մեր բարձր մուտացիայի ենթարկված սաղմերին և ցուցադրում է չափազանց ուժեղացված β-կատու:գունավորում (D'):PI3K-AKT ուղու ակտիվացումից հետո հսկիչ բջիջները մնացին խորանարդաձև (E) և ունեին նորմալ β-cat (E') ներկում, մինչդեռ kd բջիջները ցույց տվեցին զգալիորեն բարելավված բջիջների ձևը (F) և β-կատվի (F') ներկումը, ինչը ցույց է տալիս. (G) Բջջի ձևի փոփոխության աստիճանը (AF) քանակականացվել է՝ օգտագործելով ամենաերկար չափման (երկարություն) բջիջների կլորության հարաբերակցությունը (CCR) և համապատասխան ուղղահայաց չափը (լայնությունը)՝ օգտագործելով MetaMorph ծրագրաշարը:Չմշակված (NT) SPECC1L-kd բջիջները (CCR = 3.46) զգալիորեն երկար էին, քան հսկիչ բջիջները (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13):Վերահսկիչ բջիջներում PI3K-AKT ճանապարհի Wort-ի արգելակումը բավարար էր բջիջների ձևի նմանատիպ երկարացում առաջացնելու համար (CCR=3.61, p<2.4×10-9):Նմանապես, SC-79-ի կողմից AKT ակտիվացումը SPECC1L-kd բջիջներում վերականգնեց բջիջների երկարացումը մինչև վերահսկվող մակարդակները (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12):SPECC1L-kd բջիջների վորտմանինով բուժումը հանգեցրեց ապոպտոզի ավելացման, բայց բջիջների ձևի փոփոխության հետագա աճ (CCR=3.60)՝ համեմատած չբուժված kd-ի (CCR=3.46, ns) կամ վորտմանինով մշակված հսկիչ բջիջների (3.61) հետ, որոնք դիտվել են .ns = նշանակություն չունի:Ցուցադրված են +/- SEM չափումները 50 բջիջների համար:Վիճակագրական տարբերությունները հաշվարկվել են Student's t-test-ի միջոցով:
(A) PI3K-AKT ուղու արգելակման և ակտիվացման սխեմատիկ ներկայացում, որը հանգեցնում է համապատասխանաբար AJ-ի փոփոխությունների և փրկության:(B) Առաջարկվող մոդելը AKT սպիտակուցի կայունացման համար SPECC1L-ով:
Պրեմիգրացիոն CNCC-ները պահանջում են AJ lysis՝ առաջի նյարդային ծալքի նեյրոէպիթելային բջիջներից անջատվելու համար1,15,32:AJ բաղադրիչների ներկման ավելացումը և գագաթային-բազալ AJ-ի ասիմետրիկ բաշխման կորուստը SPECC1L-ի անբավարար բջիջներում ինչպես in vitro, այնպես էլ in vivo-ում, զուգորդված SPECC1L-ի β-կատենինին ֆիզիկական մոտ լինելու հետ, հուշում են, որ SPECC1L-ը գործում է AJ-ի տեղական կայունությունը պատշաճ կերպով պահպանելու համար: կազմակերպման մկանները.ակտինի ցիտոկմախք.SPECC1L-ի կապը ակտինի ցիտոկմախքի և β-կատենինի հետ և SPECC1L-ի բացակայության դեպքում խտացված ակտինի թելերի քանակի աճը համահունչ է AJ-ի խտության նկատված աճին:Մեկ այլ հնարավորությունն այն է, որ SPECC1L-ի պակաս ունեցող բջիջներում ակտինի մանրաթելերի ավելացումը հանգեցնում է միջբջջային լարվածության փոփոխության:Քանի որ բջջային սթրեսը ազդում է AJ 33 դինամիկայի վրա, լարման փոփոխությունները կարող են հանգեցնել ավելի ցրված AJ 34-ի:Այսպիսով, ցանկացած փոփոխություն կազդի CNCC շերտերի վրա:
Wnt1-ն արտահայտվում է վաղ նյարդային ծալքերում, որոնք առաջացնում են նյարդային գագաթի բջիջներ:Այսպիսով, Wnt1-cre տոհմերի հետագծումը նշում է ինչպես նախնական, այնպես էլ միգրացիոն NCC35-ը:Այնուամենայնիվ, Wnt1-ը նաև նշում է ուղեղի հյուսվածքի թիկունքային կլոնները, որոնք նույնպես առաջացել են վաղ նյարդային ծալքերից 35,36, ինչը հավանական է դարձնում, որ բաց նյարդային ծալքերում Wnt1 մարկերների համար մեր E9.5 մուտանտների ներկումը CNCC չէ:Մեր դրական ներկումը NCC մարկերների AP2A և SOX10 համար հաստատեց, որ Speccc11 մուտանտ սաղմերի մերկացած նյարդային ծալքերը իսկապես պարունակում էին CNCC:Բացի այդ, քանի որ AP2A-ն և SOX10-ը վաղ գաղթող NCC-ի մարկերներ են, դրական ներկումը ցույց է տալիս, որ այս բջիջները հետմիգրացիոն CNCC են, որոնք չեն կարող շերտավորվել E9.5-ով:
Մեր տվյալները ցույց են տալիս, որ SPECC1L-ով AJ-ի մոլեկուլային կարգավորումը միջնորդվում է PI3K-AKT ազդանշանով:AKT ազդանշանը կրճատվում է SPECC1L անբավարար բջիջներում և հյուսվածքներում:Գտածոները Fantauzzo et al.աջակցում է PI3K-AKT ազդանշանի անմիջական դերին գանգուղեղային մորֆոգենեզում:(2014) ցույց է տվել, որ PDGFRα-ի վրա հիմնված PI3K-AKT ազդանշանային ազդանշանի ակտիվացման բացակայությունը հանգեցնում է քիմքի ճեղքվածքի ֆենոտիպին:Մենք նաև ցույց ենք տալիս, որ PI3K-AKT ուղու արգելակումը բավարար է AJ-ի և բջիջների ձևը U2OS բջիջներում փոխելու համար:Համապատասխան մեր բացահայտումներին՝ Քեյնը և այլք.37-ը ցույց է տվել, որ էնդոթելային բջիջներում PI3K α110 ենթամիավորի նվազեցումը հանգեցնում է բջջային β-կատենինի ներկման նմանատիպ աճի, որը կոչվում է «կապակցման ինդեքսի» աճ:Այնուամենայնիվ, էնդոթելային բջիջներում, որոնց ակտինի թելերն արդեն բարձր կազմակերպված են, PI3K-AKT ուղու ճնշումը հանգեցնում է թուլացած բջիջների ձևի:Ի հակադրություն, SPECC1L-kd U2OS բջիջները ցույց տվեցին երկարացված բջիջի ձև:Այս տարբերությունը կարող է հատուկ լինել բջիջների տեսակին:Մինչ PI3K-AKT ազդանշանի ճնշումը մշտապես ազդում է ակտինի ցիտոկմախքի վրա, բջջի ձևի վրա ազդեցությունը որոշվում է լարվածության փոփոխություններով, որոնք պայմանավորված են կենտրոնական ակտին մանրաթելերի խտության և կազմակերպման փոփոխություններով:U2OS բջիջներում մենք օգտագործել ենք միայն բջիջների ձևի փոփոխությունները՝ որպես SPECC1L-ի անբավարար AJ փոփոխության և վերականգնման նշիչ:Եզրափակելով, մենք ենթադրում ենք, որ AKT ուղու արգելակումը SPECC1L-ի անբավարարության դեպքում մեծացնում է AJ-ի կայունությունը և նվազեցնում շերտազատումը CNCC-ում:
Հետաքրքիր է, որ pan-AKT մակարդակները կրճատվել են in vitro և in vivo, ի լրումն ֆոսֆորիլացված 473-AKT մակարդակների SPECC1L-ի բացակայության դեպքում, ինչը հուշում է PI3K-AKT ազդանշանի կարգավորումը AKT սպիտակուցի կայունության կամ շրջանառության մակարդակում:SPECC1L և MID1 գեները, որոնք երկուսն էլ կապված են Opitz/GBBB համախտանիշի հետ, կոդավորում են միկրոխողովակները կայունացնող սպիտակուցներ 18,22:Մեխանիզմը, որով SPECC1L-ը և MID1-ը միջնորդում են միկրոխողովակների կայունացումը, լիովին հասկանալի չէ:SPECC1L-ի դեպքում այս կայունացումը ներառում է միկրոխողովակների ենթախմբի ուժեղացված ացետիլացում 18:Հնարավոր է, որ SPECC1L-ն օգտագործում է նմանատիպ մեխանիզմ՝ կայունացնելու այլ սպիտակուցներ, ինչպիսիք են AKT-ն:Ցույց է տրվել, որ AKT սպիտակուցում լիզինի մնացորդների ացետիլացումը հանգեցնում է մեմբրանի տեղայնացման և ֆոսֆորիլացման նվազմանը38:Բացի այդ, K63 շղթայի ubiquitination-ը նույն լիզինի մնացորդի վրա AKT-ի վրա պահանջվում է դրա մեմբրանի տեղայնացման և ակտիվացման համար39,40:SPECC1L սպիտակուցների հետ փոխազդող մի քանի գործոններից, որոնք հայտնաբերված են տարբեր բարձր թողունակությամբ խմորիչ երկու հիբրիդային էկրաններում, չորսը՝ CCDC841, ECM2942, APC և UBE2I43, ներգրավված են սպիտակուցի շրջանառության կամ կայունության մեջ՝ ուբիկվիտինացիայի կամ սումոյլացման միջոցով:SPECC1L-ը կարող է ներգրավված լինել AKT լիզինի մնացորդների հետթարգմանական փոփոխության մեջ՝ ազդելով AKT կայունության վրա:Այնուամենայնիվ, SPECC1L-ի կարևոր դերը AKT սպիտակուցի տեղայնացման և կայունության մեջ դեռևս պետք է պարզվի:
SPECC1L արտահայտման լուրջ թերությունները in vivo հանգեցրել են AJ մարկերի ներկման և թերի CNCC ծածկույթի, ինչպես նաև ապոպտոզի և վաղ սաղմնային մահացուության ավելացման:Նախորդ զեկույցները ցույց են տվել, որ մկների մուտանտները ապոպտոզի բարձր մակարդակով կապված են նյարդային խողովակի 44,45,46,47 և գանգուղեղային արատների հետ48:Ենթադրվում է, որ նեյրոնային ծալքերում կամ ֆարինգիալ կամարներում բջիջների չափազանց մեծ մահը կարող է հանգեցնել բջիջների անբավարար քանակի, որոնք պահանջվում են պատշաճ մորֆոգենետիկ շարժման համար 48,49,50:Ի հակադրություն, մեր SPECC1L թերի բջջային գծերը չափավոր կրճատված SPECC1L արտահայտությամբ ցույց տվեցին միայն AJ փոփոխություններ՝ առանց բջիջների մահվան աճի ապացույցների:Այնուամենայնիվ, այս Kd բջիջներում PI3K-AKT ուղու քիմիական արգելակումը հանգեցրեց ապոպտոզի աճի:Այսպիսով, SPECC1L արտահայտման կամ ֆունկցիայի չափավոր նվազումը ապահովում է բջիջների գոյատևումը:Սա համահունչ է այն դիտարկմանը, որ հազվագյուտ Specc11 մուտանտի սաղմերը, որոնք փախչում են ձերբակալությունից ս.E9.5-ը, միգուցե գեների գրավման արդյունավետության նվազման շնորհիվ, կարող է փակել իրենց նյարդային խողովակները և դադարեցնել զարգացումը, հաճախ գանգուղեղային արատներով (նկ. S3):Սրա հետ համահունչ է նաև հետերոզիգոտ Spec1l սաղմերի հազվագյուտ երևույթը գանգուղեղային անոմալիաներով, հավանաբար գեների գրավման արդյունավետության բարձրացման պատճառով, ինչպես նաև զեբրաձկան հայտնաբերումը, որտեղ SPECC1L երկու օրթոլոգներից մեկը (specc1lb) առաջացնում է ուշ սաղմնային ֆենոտիպերի կորուստ: ստորին ծնոտներ և երկկողմանի ճեղքեր51.Այսպիսով, մարդկային հիվանդների մոտ հայտնաբերված հետերոզիգոտ SPECC1L ֆունկցիայի կորստի մուտացիաները կարող են առաջացնել SPECC1L ֆունկցիայի փոքր խանգարումներ գանգուղեղային մորֆոգենեզի ժամանակ, ինչը բավարար է նրանց բերան-դեմքի ճեղքերը բացատրելու համար:SPECC1L-ի վրա հիմնված միջբջջային շփումների կարգավորումը կարող է նաև դեր խաղալ ֆարինգիալ կամարների պալատոգենեզի և միաձուլման գործում:SPECC1L ֆունկցիայի հետագա ուսումնասիրությունները կօգնեն պարզել CNCC-ում ժամանակավոր միջբջջային կոնտակտների դերը նյարդային խողովակի փակման ժամանակ նեյրոէպիթելային բջիջների շարժունակության և գանգուղեղային մորֆոգենեզում:
U2OS օստեոսարկոմայի հսկողությունը և SPECC1L-kd բջիջները նախկինում նկարագրված են (Saadi et al., 2011):SPECC1L-ի դեմ հակամարմինները նույնպես նախկինում բնութագրվել են (Saadi et al., 2011):Հակաբ-կատենինի հակամարմիններ (նապաստակ; 1:1000; Սանտա Կրուզ, Դալլաս, Տեխաս) (մուկ; 1:1000; Բջջային ազդանշանային տեխնոլոգիա, Դանվերս, ՄԱ), միոզին IIb (1:1000; Սիգմա-Օլդրիչ, Սենտ Լուիս): ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, Սան Դիեգո): , Կալիֆորնիա), DLX2 (1:1000; Abcam, Քեմբրիջ, MA), ֆոսֆո-Ser473-AKT (1:1000; Բջջային ազդանշանային տեխնոլոգիա, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Բջջային ազդանշանային տեխնոլոգիա, Դանվերս, ՄԱ), ճեղքված կասպազ 3 (1:1000; Բջջային ազդանշանային տեխնոլոգիա, Դանվերս, MA) և β-ակտին (1:2500; Սիգմա-Օլդրիչ, Սենտ Լուիս, MO ) օգտագործվել է ինչպես նկարագրված է:.Ակտինի թելերը ներկվել են Acti-stain rhodamine phalloidin-ով (Cytoskeleton, Denver, Colorado):
U2OS հսկիչ բջիջները և SPECC1L-kd բջիջները մշակվել են ստանդարտ բարձր գլյուկոզայի DMEM-ում, որը համալրված է 10% պտղի խոշոր եղջերավոր շիճուկով (Life Technologies, Carlsbad, CA):AJ-ի փոփոխությունների համար 2 x 105 բջիջներ ցանվել են 0,1% խոզի ժելատինով մշակված ապակու վրա (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) և դիտարկվել բջիջների ձևի փոփոխության համար:Բջիջները հավաքվել են տարբեր նշված ժամանակային կետերում՝ ցանելուց 4 ժամ հետո (t = 1), ցանքից 24 ժամ հետո (t = 2), միաձուլում առանց բջիջի ձևի փոփոխության (t = 3), բջջի ձևի փոփոխություն (t = 4) , բջիջի ձևի փոփոխությունից 24 ժամ հետո (t = 5) և 48 ժամ հետո բջիջի ձևի փոփոխությունից (t = 6) (նկ. 1, 2, 3):PI3K-AKT ուղին մոդուլավորելու համար բջիջները մշակվել են նշված կոնցենտրացիաներում PI3K-AKT ինհիբիտոր վորտմանինով (TOCRIS Biosciences, Մինեապոլիս, Մինեսոտա) կամ SC-79 ակտիվացնողով (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota):Քիմիական նյութեր պարունակող միջավայրը փոխվում էր ամեն օր:
Կադր առ կադր ձայնագրություններ են արվել կենդանի հսկողության և KD բջիջների վրա՝ նորմալ կուլտուրայի պայմաններում, և փուլային կոնտրաստային պատկերները հավաքվել են յուրաքանչյուր 10 րոպեն մեկ 7 օրվա ընթացքում:Պատկերները ձեռք են բերվել համակարգչային կառավարվող Leica DM IRB շրջված մանրադիտակի միջոցով, որը հագեցած է մեխանիկական բեմով և 10 × N-PLAN օբյեկտով, որը միացված է QImaging Retiga-SRV տեսախցիկին:Պատկերման ընթացքում բջիջների կուլտուրաները պահպանվել են 37°C ջերմաստիճանում՝ 5% CO2 պարունակող խոնավ մթնոլորտում:
Երկու գենային թակարդ ES բջջային գծեր DTM096 և RRH048 Տարածաշրջանային մուտանտ մկնիկի ռեսուրսների կենտրոնից (UC Davis, CA) օգտագործվել են Specc11-ի անբավարար մկնիկի գծեր ստեղծելու համար, որոնք նշանակված են Specc1lgtDTM096 և Spec1lgtRRH046:Համառոտ, 129/REJ ES բջիջները ներարկվել են C57BL6 բլաստոցիստների մեջ:Ստացված քիմերային արու մկները բուծվել են էգ C57BL6 մկների հետ՝ հայտնաբերելու ագուտի ծածկույթի գունավորմամբ սերունդներին:Գենային թակարդի վեկտորի ներդիրների առկայությունը օգտագործվել է հետերոզիգոտների նույնականացման համար:Մկները պահվում էին 129/REJ;C57BL6 խառը ֆոնի վրա:Գենետիկ թակարդի վեկտորի ներդրման վայրի գտնվելու վայրը հաստատվել է RT-PCR-ով, գենոմի հաջորդականությամբ և գենետիկական լրացմամբ (Լրացուցիչ նկար 1):Կրկնակի հետերոզիգոտ Specc1lGT մկների CNCC տոհմը հետագծելու համար ROSAmTmG (#007576) և Wnt1-Cre (#003829) մկները (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) խաչվել են՝ ROSamTmG և WntTmG և WntTmG incccC-ն արտադրելու համար:Բոլոր փորձերը մկների վրա իրականացվել են Կանզասի համալսարանի բժշկական կենտրոնի Կենդանիների խնամքի և օգտագործման ինստիտուտի կողմից հաստատված արձանագրությունների համաձայն:
Սաղմերը ամրագրվեցին (1% ֆորմալդեհիդ, 0,2% գլյուտարալդեհիդ, 2 մՄ MgCl2, 0,02% NP-40, 5 մՄ EGTA) 60 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում:X-gal ներկման լուծույթում (5 mM կալիումի ֆերիցիանիդ, 5 mM կալիումի ֆերոցյանիդ, 2 mM MgCl2, 0.01% նատրիումի դեզօքսիքոլատ, 0.02% NP-40, 1 մգ/մլ X-gal) բիծի մշակումը կատարվել է 37°C-ում: .°C 1-6 ժամվա ընթացքում:Սաղմերը հետ-ֆիքսվել են 4% PFA-ում և տեսողականացվել:
Western blotting-ի համար բջիջները լիզվել են պասիվ լիզի բուֆերում (Promega, Fitchburg, WI)՝ համալրված HALT պրոթեզերոնի ինհիբիտորների խառնուրդով (Sigma-Oldrich, St. Louis, MO):Լիզատները մշակվել են 12% պոլիակրիլամիդ Mini-PROTEAN TGX պատրաստի գելերի վրա (Bio-Rad, Hercules, CA) և տեղափոխվել Immobilon PVDF մեմբրաններ (EMD Millipore, Billerica, MA):Թաղանթները արգելափակվել են 5% կաթում PBS-ում, որը պարունակում է 0,1% Tween:Հակամարմինները ինկուբացվել են գիշերը 4°C-ում կամ մեկ ժամ սենյակային ջերմաստիճանում:Ազդանշանի ստեղծման համար օգտագործվել է Femto SuperSignal West ECL ռեագենտը (Thermo Scientific, Waltham, MA):Իմունային ներկման համար սաղմերը ֆիքսվել են մեկ գիշերվա ընթացքում 4% PFA/PBS-ում և կրիոպահպանվել:Հյուսվածքների կրիոսեկցիան արգելափակվել է PBS-ում, որը պարունակում է 1% նորմալ այծի շիճուկ (Thermo Scientific, Waltham, MA) և 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) և այնուհետև ինկուբացվել է 4°C-ում ինկուբատորում: գիշեր.հակամարմիններով և լյումինեսցենտային երկրորդային հակամարմիններով (1:1000) 1 ժամ 4°C-ում:Ներկված հատվածները տեղադրվեցին ProLong ոսկե միջավայրում (Thermo Scientific, Waltham MA) և հարթ պատկերներ ստացվեցին Leica TCS SPE կոնֆոկալ մանրադիտակի միջոցով:Յուրաքանչյուր իմունային գունավորում իրականացվել է որպես երեք անկախ փորձ առնվազն երկու մուտանտ սաղմերի ցիրոսեկտացիաների վրա:Ներկայացված է ներկայացուցչական փորձ:
Բջիջները ինկուբացվել են մոդիֆիկացված RIPA բուֆերում (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% գլիցերին, 2 mM EDTA և HALT պրոթեզերոնի արգելակիչ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Համառոտ, լիզատները նախապես մաքրվել են G սպիտակուցի մագնիսական բշտիկներով (Life Technologies, Carlsbad, CA) և այնուհետև ինկուբացվել գիշերը 4°C-ում: anti-SPECC1L կամ IgG պրոտեին G սպիտակուցային բշտիկներով օգտագործվել են SPECC1L-ի արդյունահանման համար, և արվել է Western blotting՝ օգտագործելով հակահայկական: -β-catenin հակամարմին, որը նկարագրված է վերևում Ցուցադրված co-IP փորձերը ներկայացնում են չորս անկախ փորձեր:
Ֆիքսված աճեցված բջիջները կամ մկան սաղմնային հյուսվածքները տրամադրվել են Կանզասի համալսարանի բժշկական կենտրոնի էլեկտրոնային մանրադիտակի կենտրոնին:Համառոտ, նմուշները տեղադրվել են EMbed 812 խեժի մեջ (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), պոլիմերացվել են գիշերվա ընթացքում 60°C-ում և կտրվել 80 նմ-ում՝ օգտագործելով Leica UC7 ուլտրամիկրոտոմի, որը հագեցած է ադամանդե սայրով:Բաժինները վիզուալացվել են JEOL JEM-1400 փոխանցման էլեկտրոնային մանրադիտակի միջոցով, որը հագեցած է 100 կՎ Lab6 ատրճանակով:
Ինչպես մեջբերել այս հոդվածը. Wilson, NR et al.SPECC1L-ի անբավարարությունը հանգեցնում է զուգված հոդերի կայունության բարձրացման և գանգուղեղի նյարդային բջիջների շերտազատման նվազեցմանը:գիտությունը։6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016):
Saint-Jeanne, J.-P.Նյարդային գագաթի ինդուկցիա և տարբերակում:(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006):
Cordero, DR et al.Գանգի նյարդային բջիջները շարժման մեջ. նրանց դերը գանգուղեղային զարգացման մեջ.Բժշկական գենետիկայի ամերիկյան ամսագիր.Մաս A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011):
Boland, RP Neurocristopathia. նրա աճը և զարգացումը 20 տարվա ընթացքում:Մանկաբույժ.պաթոլոգիա.լաբորատորիա։դեղ.17, 1–25 (1997):
Մանգոլդ Է., Լյուդվիգ ԿՈՒ և Նոթեն Մ.Մ. բեկում բերանային ճեղքերի գենետիկայի մեջ:Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011):
Minu, M. and Riley, FM գանգուղեղային նեյրոնային գագաթի բջիջների միգրացիայի և ձևավորման մոլեկուլային մեխանիզմները գանգուղեղային զարգացման ընթացքում:Մշակում 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010):
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH and Murray, JK Շրթունքի և քիմքի ճեղքվածք. հասկանալ գենետիկական և շրջակա միջավայրի ազդեցությունները:բնական մեկնաբանություն.Գենետիկա 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011):
Ingram, CR et al.Մաշկի, վերջույթների և գանգուղեղային շրջանի աննորմալ մորֆոգենեզ ինտերֆերոն կարգավորող գործոն-6 (Irf6) անբավարար մկների մոտ:Ազգային Ժենետ.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006):
Peyrard-Janvid, M. et al.GRHL3-ի գերիշխող մուտացիաները առաջացնում են վան դեր Վաորդի համախտանիշ և խանգարում բերանի խոռոչի պերդերմի զարգացմանը:Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014):
Harris, MJ և Juriloff, DM Թարմացրեք մկների մուտանտների ցանկը, որոնք ունեն նեյրոնային խողովակի փակման արատներ և առաջընթաց դեպի նյարդային խողովակի փակման ամբողջական գենետիկական ըմբռնում:Ծննդաբերական արատների հետազոտություն.Մաս Ա, Կլինիկական և մոլեկուլային տերատոլոգիա 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010):
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K միջնորդավորված PDGFRalpha ազդանշանը կարգավորում է գոյատևումն ու տարածումը կմախքի զարգացման մեջ p53-ից կախված ներբջջային ճանապարհի միջոցով:Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014):
Kopp, AJ, Green, ND և Murdoch, JN Disheveled. Կոնվերգենտ ընդլայնման կապը նյարդային խողովակի փակման հետ:Նյարդաբանության միտումները.26, 453–455, doi՝ 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003):