347 չժանգոտվող պողպատից փաթաթված խողովակի քիմիական բաղադրիչ, նոր ինտերֆերոնին արձագանքող մարդկային լեյկոցիտային հակագեն-A (HLA-A) շապերոնային սպիտակուցների նույնականացում՝ օգտագործելով խաչաձեւ զանգվածային սպեկտրոմետրիա (CLMS)

Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար:Դուք օգտագործում եք զննարկչի տարբերակ՝ CSS-ի սահմանափակ աջակցությամբ:Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել Համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում):Բացի այդ, շարունակական աջակցություն ապահովելու համար մենք կայքը ցուցադրում ենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Սլայդերներ, որոնք ցույց են տալիս երեք հոդված յուրաքանչյուր սլայդում:Օգտագործեք հետևի և հաջորդ կոճակները՝ սլայդների միջով շարժվելու համար, կամ սլայդ կարգավորիչի կոճակները վերջում՝ յուրաքանչյուր սլայդով շարժվելու համար:

ապրանքի նկարագրությունը

Չժանգոտվող պողպատից 347L կծիկ խողովակներ, պողպատից դասի` SS347L

Ինտերֆերոնի ազդանշանային համակարգը առաջացնում է ուժեղ ցիտոկինային արձագանք շրջակա միջավայրից ստացվող պաթոգեն և ներքին պաթոլոգիական ազդանշանների լայն շրջանակի նկատմամբ, ինչը հանգեցնում է ինտերֆերոնի ինդուկտիվ պրոտեինների ենթաբազմությունների ինդուկցիային:Մենք կիրառեցինք DSS-ի միջնորդավորված խաչաձեւ կապի զանգվածային սպեկտրոմետրիա (CLMS)՝ հայտնաբերելու սպիտակուց-սպիտակուցի նոր փոխազդեցությունները ինտերֆերոնից առաջացած սպիտակուցների տիրույթում:Ի լրումն ակնկալվող ինտերֆերոնի ինդուկտիվ սպիտակուցների, մենք նաև հայտնաբերեցինք նոր միջմոլեկուլային և ներմոլեկուլային խաչաձև կապակցված կանոնական ինտերֆերոնի ինդուկտիվ սպիտակուցներ, ինչպիսիք են MX1, USP18, OAS3 և STAT1:Մենք կենտրոնացել ենք HLA-A սպիտակուցների (H2BFS-HLA-A-HMGA1) կողմից ձևավորված ինտերֆերոնով ինդուկտիվ սպիտակուցային ցանցերի ուղղանկյուն վավերացման վրա, և դրանց հետագա ուսումնասիրությունը՝ օգտագործելով մոլեկուլային դինամիկայի մոդելավորում:Սպիտակուցային համալիրի կոնֆորմացիոն դինամիկայի մոդելավորումը բացահայտեց մի քանի փոխազդեցության վայրեր, որոնք արտացոլում էին CLMS-ի բացահայտումներում նշված փոխազդեցությունները:Միասին մենք ներկայացնում ենք CLMS-ի փորձնական ուսումնասիրություն՝ ինտերֆերոնի կողմից առաջացած նոր ազդանշանային համալիրները բացահայտելու համար և անհամբեր սպասում ենք CLMS-ի ավելի լայն կիրառմանը ուռուցքային միկրոմիջավայրում սպիտակուցների փոխազդեցության նոր դինամիկան հայտնաբերելու համար:
Նախքան հարմարվողական իմունային պատասխանը սկսելը, հյուրընկալողի բնածին պաշտպանական համակարգը հակամանրէային պատասխան է տալիս՝ միջնորդավորված ինտերֆերոնների (IFNs) արտազատվող ալֆա-պտուտակային ցիտոկինների ընտանիքի կողմից:I տիպի IFN IFNα և IFNβ դասերը ակտիվացնում են բջջային պատասխանները, ներառյալ հակավիրուսային, պրոապոպտոտիկ, պրոբորբոքային և հակաբազմացող վիճակները:Մարդկանց մոտ հայտնի են IFNα-ի 13 ենթատեսակներ, բոլորը հավաքված են 91-րդ քրոմոսոմի վրա: Զարմանալիորեն, միայն IFNα2-ն է ուսումնասիրվել կլինիկական օգտագործման համար:Վերջերս հատուկ ուշադրություն է դարձվել IFNα-ի այլ ենթատեսակների հետազոտություններին:Վերջերս կատարված ուսումնասիրությունը ցույց տվեց, որ IFNα14-ը HBV2-ի և ՄԻԱՎ-13,4-ի վերարտադրությունը սահմանափակելու ամենաարդյունավետ իզոֆորմներից մեկն է՝ համեմատած կանոնական IFNα2 ենթատեսակի հետ:
Հաստատվել է, որ ակտիվացված տիպի I ինտերֆերոնի ընկալիչների համալիրները (IFNAR1 և IFNAR2) առաջացնում են ազդանշանի փոխակերպման կասկադ՝ միջնորդավորված Janus kinases TYK2 և JAK15,6:Այս Janus kinases-ը ֆոսֆորիլացնում են ազդանշանային փոխարկիչները և տրանսկրիպցիոն սպիտակուցային ակտիվացնողները (STAT1 և STAT2) թիրոզինի մնացորդների վրա՝ սկսելու SH2 տիրույթի միջնորդավորված հետերոդիմերացում6:Այնուհետև, IRF9-ը կապում է STAT հետերոդիմերներին՝ ձևավորելով IFN-ով խթանված գործոն 3 գենի (ISGF3) տրիմերային համալիր, որը տեղափոխվում է միջուկ և հրահրում է ավելի քան 2000 ինտերֆերոնով խթանված գեների (ISGs) տառադարձում5,6,7,8:
ISG-ները կազմում են բնածին իմունային համակարգի ողնաշարը, հատկապես ի պատասխան վիրուսային հարձակման:Որպես վիրուսային վարակի դեմ պաշտպանության առաջին գիծ, ​​բջիջները արագորեն տեղակայում են բջջային սպիտակուցների լայնածավալ փոխազդեցությունները կենսաբանական գործունեության լայն շրջանակով:Այս սպիտակուցները ներառում են օրինաչափությունների ճանաչման ընկալիչները, ազդանշանային մոլեկուլները, տրանսկրիպցիոն գործոնները և ուղղակի հակավիրուսային ֆունկցիաներով սպիտակուցներ, ինչպես նաև իմունային պատասխանների բացասական կարգավորիչներ9:ISG-ի գործունեության մասին տեղեկատվության մեծ մասը գալիս է ֆունկցիոնալ էկրաններից, որոնք օգտագործում են գերարտահայտման էկրաններ10,11 կամ գեների խլացման տեխնիկա (siRNA, RNAi և CRISPR)12,13, որոնցում առանձին ISG-ներն արտահայտվում կամ արգելակվում են, և դրանց ակտիվությունը փորձարկվում է տարբեր վիրուսների վրա:Չնայած այս ուսումնասիրությունները որոշել են առանձին ISG-ների հակավիրուսային հատկությունները, յուրաքանչյուր ISG-ի հիմքում ընկած մոլեկուլային մեխանիզմները հիմնականում անհայտ են մնում:Ընդհանրապես ընդունված է, որ շատ սպիտակուցներ փոխազդում են մեկ կամ մի քանի ցիտոկինների հետ՝ լիարժեք ակտիվություն ապահովելու համար, ուստի կամ ISG-ները ուղղակիորեն փոխազդում են, կամ նրանց փոխազդեցությունները միջնորդավորված են բջջային սպիտակուցներով:Օրինակ, վերջերս ֆոտոխաչկապակցված պրոտեոմիկայի ուսումնասիրությունը բացահայտեց ATPase VCP/p97-ը որպես IFITM3 փոխազդեցության հիմնական գործընկեր, որի արգելակումը հանգեցնում է լիզոսոմային տեսակավորման, շրջանառության և վիրուսային մասնիկների հետ IFITM3-ի համատեղ փոխադրման թերությունների 14:Օգտագործելով իմունային նստվածքը, մենք հայտնաբերեցինք VAPA-ն՝ վեզիկուլների հետ կապված սպիտակուցը, որպես IFITM1/2/3-ի հետ փոխազդեցության գործընկեր, որը միջնորդում է խոլեստերինի միջնորդավորված վիրուսային հասունացմանը, և դա հաստատվեց մեկ այլ ուսումնասիրությամբ՝ օգտագործելով խմորիչ երկու հիբրիդային համակարգ:Գիտական ​​աջակցություն 15, 16.
Հիմնական կենսաբանական պրոցեսը, որը ներգրավված է վարակի և չարորակ փոխակերպման ճնշելու մեջ, հակագենի ներկայացումն է, որը միջնորդվում է հիմնական հիստոմատատելիության համալիրի (MHC) մոլեկուլներով:Պեպտիդները (8-12 ամինաթթու երկարությամբ) ճեղքված, վաղաժամ ավարտված կամ սխալ ծալված սպիտակուցներից բեռնվում են MHC-I հետերոդիմերում (բաղկացած MHC-I ծանր և թեթև շղթաներից, որը կոչվում է β-2-միկրոգլոբուլին; β2M) 17,18:Ստացված կայուն MHC-I տրիմերները տեղափոխվում են բջջի մակերես, որտեղ դրանք ներկայացնում են ներբջջային պեպտիդներ CD8+ T բջիջներում (ցիտոտոքսիկ T բջիջներ)17:T բջիջները ճանաչում և ոչնչացնում են այս պաթոգենները և ուռուցքին հատուկ հակագեն կրող բջիջները:Հետևաբար, պաթոգենները և ուռուցքային բջիջները հաճախ ճնշում են հակագենի ներկայացման գործընթացը՝ խուսափելու իմունային հսկողությունից:Ի լրումն, MHC-I-ը նվազեցված է մարդու ուռուցքների 40-90%-ի մոտ և հաճախ կապված է ավելի վատ կանխատեսման հետ19:
Պաթոգեններին արձագանքելու մեջ ներգրավված գեները պետք է արագ անցնեն հանգստի և ակտիվ տրանսկրիպցիայի վիճակի միջև:Հետևաբար, ենթադրվում է, որ մի քանի բջջային սպիտակուցներ ներգրավված են IFN-ի բարձր պահանջարկի պատասխանում կարճ ժամանակահատվածներում, ներառյալ պրոմոտոր քրոմատինի վերափոխումը և փոփոխումը 20,21:Ուսումնասիրությունների մեծ մասը կենտրոնացած է ISG սպիտակուցի առանձին գործընկերների նույնականացման վրա IFN-ի առկայության դեպքում:Բջջային մոդելային համակարգերում մի քանի պրոտեոմիկ և տրանսկրիպտոմիկ հետազոտություններ պարզել են IFN-ի ազդեցությունը բջջային լանդշաֆտի վրա:Այնուամենայնիվ, չնայած ինտերֆերոնների կողմից առաջացած դինամիկայի աճող ըմբռնմանը, մենք դեռ քիչ բան գիտենք ISG-ների ներգրավվածության մասին:Ինտերֆերոնի ազդանշանման բարդությունն ու ժամանակից կախված դինամիկան դիտարկելիս առաջանում է երկու հարց. (i) հնարավո՞ր է կայունացնել և թակարդել բազմապրոտեինային համալիրները, որոնք ներգրավված են արագ ազդանշանման մեջ, և (ii) կարո՞ղ են այդ փոխազդեցությունները քարտեզագրվել 3D տարածության մեջ:
Այս խնդիրները լուծելու համար մենք իրականացրեցինք դիսուկցինիմիդի սուբերատով միջնորդավորված քիմիական խաչաձև կապում (DSS)՝ զուգորդված զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (CLMS) հետ՝ ուսումնասիրելու IFNα-ով առաջացած սպիտակուցների փոխազդեցության ցանցը և դրա դինամիկան:DSS-ն ավելացնում է կովալենտային կապեր սպիտակուցների մոտակա մնացորդների և/կամ սպիտակուցային համալիրների միջև in vivo-ում:Հետագա MS վերլուծությունը բացահայտում է խաչաձև կապող հատուկ տեղամասեր, որոնք արտացոլում են որոշակի սպիտակուցի մեջ գտնվող շրջանների տարածական մոտիկությունը, որը կոչվում է ներքին կապեր կամ ենթամիավորներ սպիտակուցային համալիրներում, որոնք կոչվում են փոխհարաբերություններ:Օգտագործելով այս մոտեցումը՝ մենք հայտնաբերել ենք մի քանի նոր սպիտակուց-սպիտակուցային բարդույթներ, ինչպես նաև ինտերֆերոնից առաջացած բազմապրոտեինային փոխազդեցության ցանցեր:Հետագա փորձարկելով այս նոր փոխազդեցությունների ենթաբազմությունը՝ մենք ցույց ենք տալիս, որ H2BFS-ը (H2B հիստոնային տիպի FS, այսուհետ՝ H2B) և MDN1-ը գործում են որպես HLA-A-ի պարտադիր գործընկերներ:
Flo-1 բջիջները կերակրափողի ադենոկարկինոմայի ամենահայտնի in vitro մոդելներից են, քանի որ դրանք նմանակում են կերակրափողի ուռուցքների հիմնական հատկանիշները22,23:Այնուամենայնիվ, ոչ բոլոր ուռուցքներն են իմունոգեն, և որոշելու համար, թե արդյոք Flo-1 բջիջները արձագանքում են ինտերֆերոնով բուժմանը, մենք Flo-1 բջիջները բուժել ենք 10 նգ/մլ IFNα-ով 72 ժամ:Flo-1 բջիջները ցույց են տվել pSTAT1-ի և IRF1-ի վաղ ինդուկցիա՝ սկսած բուժումից 2 ժամ հետո և շարունակվելով 72 ժամ՝ IRF1-ի ստացիոնար մակարդակների ժամանակից կախված նվազմամբ (Նկար 1Ա):Պարզվել է, որ ISG-ները (MX1, IFITM1, OAS1/2 և ISG15) ուժեղ ինդուկտիվ են 6 ժամ հետո՝ ընդօրինակելով IFNα-ի դասական միջին և ուշ փուլի պատասխանները (Նկար 1Ա):Միասին այս տվյալները հուշում են, որ այս բջջային մոդելը կարող է օգտագործվել ինտերֆերոնի արձագանքներն ուսումնասիրելու համար:
Դիֆերենցիալ սպիտակուցային արտահայտման պատասխանները Flo-1 բջիջներում IFNα բուժումից հետո:(A) Սպիտակուցի արտահայտությունը Flo-1 բջիջներում, որոնք մշակվել են 10 նգ/մլ IFNα-ով 2, 6, 24, 48 և 72 ժամվա ընթացքում, վերլուծվել է իմունոբլոտի միջոցով՝ օգտագործելով նշված ISG հակամարմինները:(B) Coomassie կապույտ ներկված SDS-PAGE գելեր ամբողջական բջիջների էքստրակտներից DSS-ի հետ խաչաձև կապելուց հետո նշված ժամանակների և կոնցենտրացիաների համար:(C) Ներկայացուցչական իմունոբլոտ, որը հետազոտվել է նույն նմուշներից p53(DO-1) հակամարմիններով՝ գնահատելու սպիտակուցների խաչաձեւ կապակցման աստիճանը:
In situ սպիտակուցների փոխազդեցության լանդշաֆտը պատկերելու համար մենք օգտագործեցինք DSS՝ լայնորեն օգտագործվող խաչաձև կապող միջոց՝ շնորհիվ իր բարձր թաղանթային թափանցելիության և արձագանքման համեմատաբար կարճ ժամանակի:Ավելի կարճ արձագանքման ժամանակն օգնում է կանխել խաչաձև կապակցված սպիտակուցների խոշոր ագրեգատների ձևավորումը՝ դրանով իսկ պահպանելով խաչաձև կապի կայունությունը:DSS-ի օպտիմալ կոնցենտրացիան որոշելու և ավելորդ խաչաձեւ կապից խուսափելու համար մենք նախ բջիջները ենթարկեցինք 5, 2,5 և 1 մՄ DSS համապատասխանաբար 5, 10, 5 և 30 րոպե, և վերլուծեցինք լիզատները Coomassie-ով ներկված SDS-PAGE-ով: (տվյալները չեն ցուցադրվում):Բջջային լիզատները, ըստ երևույթին, խիստ խաչաձև կապված են ամենացածր կոնցենտրացիայի և ամենակարճ ժամանակում:Հետևաբար, DSS-ը տիտրվել է մինչև 1, 0.5 և 0.1 մՄ 5 րոպեի ընթացքում (Նկար 1B):Օպտիմալ խաչաձև կապը դիտվել է 0,5 մՄ DSS-ով 5 րոպեի ընթացքում, և այս պայմաններն ընտրվել են IFNα-ով մշակված բջիջների համար:Ի հավելումն, Նկար 1C-ում ներկայացված է Western blot-ը, որն իրականացվել է p53 (DO-1) հակամարմինի միջոցով՝ գնահատելու սպիտակուցների խաչաձև կապակցման աստիճանը:
Flo-1 բջիջները մշակվել են 10 նգ/մլ IFNα-ով 24 ժամ, նախքան խաչմերուկը ավելացնելը:Խաչաձև կապակցված բջիջները այնուհետև լուծվեցին երկաստիճան պրոտեոլիզով, իսկ սպիտակուցները մշակվեցին FASP-ով (նկ. 2)24,25:Խաչաձև կապակցված տրիպտիկ պեպտիդները վերլուծվել են զանգվածային սպեկտրոմետրիայի միջոցով (նկ. 2):Այնուհետև MS/MS սպեկտրները համընկնում են սպիտակուցի հաջորդականության հետ և քանակականացվում MaxQuant26,27-ով:Ստացված սպեկտրներից հայտնաբերվեցին խաչակցված պեպտիդներ՝ օգտագործելով SIM-XL ծրագիրը, և առանձին միացություններ միավորվեցին բարդ ցանցում՝ օգտագործելով xQuest28 և SIM-XL29 բաց կոդով հաշվողական ծրագրային խողովակաշարերը (նկ. 2):SIM-XL-ը նույնացնում է սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցությունները, ներքին շղթաները և առանձին շղթաները պարզ կամ բարդ սպիտակուցային խառնուրդներում և տրամադրում է սկրիպտներ սպիտակուցային կառուցվածքներում փոխազդեցությունները պատկերացնելու համար:Բացի այդ, այն դասակարգում է յուրաքանչյուր խաչաձև հղումը որպես ID միավոր՝ ըստ MS/MS29 սպեկտրի որակի:Բացահայտվել են մի քանի բարձր հուսալի պրոտեին-սպիտակ փոխազդեցություններ և բարդույթներ, և փոխազդեցությունների նոր շարքը հետագայում ուսումնասիրվել է՝ օգտագործելով մոլեկուլային դինամիկայի (MD) մոդելավորումը օգտագործող կոմպլեքսների համատեղ իմունային նստվածքը և կոնֆորմացիոն փոփոխությունները (նկ. 2) 30, 31:
CLMS մեթոդի սխեմատիկ ակնարկ:Flo-1 բջիջները մշակվել են 10 նգ/մլ IFNα 24 ժամվա ընթացքում, որին հաջորդել է in situ սպիտակուցի խաչաձև կապը DSS-ի միջոցով, որին հաջորդել է բջիջների լիզումը և տրիպսինացումը:Խաչաձև կապակցված նմուշները վերլուծվել են Orbitrap զանգվածային սպեկտրոմետրի միջոցով և հետագայում նմուշառվել պեպտիդային պրեկուրսորների մասնատման համար LC-MS/MS-ի ընթացքում:Ստացված սպեկտրից հայտնաբերվեցին երկու կապակցված պեպտիդներ՝ օգտագործելով Crosslinked Peptides (SIM-XL) ծրագրի սպեկտրի ճանաչման մեքենան, և բոլոր միացությունները միավորվեցին բարդ ցանցում՝ օգտագործելով հաշվողական խողովակաշարերը:Զտեք ցածր վստահության փոխազդեցությունները՝ հիմնված կեղծ դրական դրույքաչափերի (FDR) միավորների վրա:Մի քանի նոր բարձր հավատարմություն սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցություններ հետագայում հաստատվեցին՝ օգտագործելով համատեղ իմունային նստվածք, և կոմպլեքսներում կոնֆորմացիոն փոփոխությունները հետազոտվեցին՝ օգտագործելով մոլեկուլային դինամիկայի (MD) մոդելավորում:
Ընդամենը ~ 30,500 և ~ 28,500 պեպտիդներ են հայտնաբերվել MaxQuant-ի միջոցով չխթանված և խթանված IFNα նմուշներում, համապատասխանաբար (Լրացուցիչ աղյուսակ S1, նկ. 3Ա):Պեպտիդների երկարության բաշխումը երկու դեպքում էլ ցույց է տվել ավելի մեծ պեպտիդների համամասնությունը, ինչը ցույց է տալիս խաչաձեւ կապակցված պեպտիդների առկայությունը (նկ. 3B,C):Բացի այդ, ավելի մեծ պեպտիդների ավելի մեծ մասնաբաժին կա 40-55 միջակայքում IFNα-ով մշակված նմուշներում (նկ. 3C):Սպիտակուցների քարտեզագրումն ընդդեմ log2 ինտենսիվության ցույց տվեց, որ դասական ինտերֆերոնով խթանված սպիտակուցներն ամենաշատն են՝ համեմատած չմշակված նմուշների հետ, ներառյալ MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 և HLA-F (Նկար 3D):Երեք անգամից ավելի հարստացված սպիտակուցների ուղիների վերլուծությունը՝ ի պատասխան IFNα բուժման, օգտագործելով Reactome ուղիների տվյալների բազան, ցույց տվեց, որ MHC-I-ի միջնորդավորված անտիգենի ներկայացումն ու մշակումը ամենադոմինանտ ճանապարհն էր (Նկար 3E):Համապատասխան ավելի վաղ զեկույցների, հակավիրուսային պատասխանները՝ միջնորդավորված OAS-ի և ISG15-ի, ինչպես նաև IFNα/β-ի և ցիտոկինային ազդանշանների միջոցով, ակտիվացված ուղիներից էին:Ի լրումն, լիզինին և սերինին հատուկ սպիտակուցների խաչաձև կապերը հայտնաբերվել են սկզբնապես ձեռք բերված MS/MS սպեկտրից՝ օգտագործելով SIM-XL:Վերջերս կատարված ուսումնասիրությունը հաղորդում է 104 ISG-ների մասին, որոնք ընդգրկում են 20 վիրուսներ 9 վիրուսների դասերից՝ 5 բջիջների տիպի ISG գերարտահայտման անհատական ​​հետազոտությունների մետա-վերլուծության միջոցով9:Այնուամենայնիվ, մեծ տվյալների հավաքածուների ցուցադրման հաշվողական սահմանափակումները հաղթահարելու համար մենք սկսեցինք ավելի փոքր տվյալներից՝ ուսումնասիրելու Padaria-ի և այլոց կողմից ներկայացված IRDS գեների ցանկի միջև հնարավոր փոխազդեցությունները, որոնց մեծ մասը ISG-ներ են:
Դիֆերենցիալ արտահայտված խաչաձեւ կապակցված սպիտակուցների նույնականացում՝ ի պատասխան IFNα-ի (տվյալներ՝ ստացված MaxQuant-ից):(A) Վենի դիագրամ, որը ներկայացնում է սովորական և բացառիկ պեպտիդների քանակը, որոնք հայտնաբերված են IFNα14-ով մշակված և չմշակված Flo-1 նմուշներում:Պեպտիդների երկարության բաշխումը չմշակված (B) և IFNα բուժված (C) խաչաձև կապակցված նմուշներում:(D) Ջերմային քարտեզ, որը ներկայացնում է log2 (LFQ ինտենսիվությունը) չմշակված և IFNα14-ով մշակված Flo-1 բջիջների միջև:Ձախ վահանակը ցույց է տալիս IFNα-ի առկայության դեպքում ամենաակտիվ ակտիվացված սպիտակուցները:(E) Հիստոգրամ, որը ներկայացնում է հարստացման 20 հիմնական ուղիները IFNα բուժումից հետո:Reactome ուղիների տվյալների բազան վերլուծել է IFNα-ին արձագանքող սպիտակուցների ավելի քան չորս անգամ փոփոխություններ:
Ինտերֆերոնի միջնորդությամբ ISG խթանումը լավ փաստագրված է, բայց մոլեկուլային մակարդակում վատ է հասկացվում, թե ինչպես են այս սպիտակուցները գագաթնակետին հասնում կենսաբանական գործառույթների լայն շրջանակում:Մենք ուսումնասիրեցինք սպիտակուցների փոխազդեցությունները հայտնի ISG-ների միջև վստահության բարձր աստիճանով:Հետաքրքիր է, որ մենք հայտնաբերել ենք ցանց, ներառյալ MX1, USP18, ROBO1, OAS3 և STAT1 սպիտակուցները, որոնք կազմում են մեծ համալիր՝ ի պատասխան IFNα բուժման (Նկար 4, Աղյուսակ S2) 32,33,34:Ամենակարևորն այն է, որ այս փոխազդեցությունները հայտնաբերվել են IFNα-ով մշակված բոլոր եռակի դեպքերում և չեն հայտնաբերվել չմշակված նմուշներում, ինչը ենթադրում է, որ դրանք ձևավորվել են հատուկ ի պատասխան IFNα բուժման:Հայտնի է, որ STAT1-ը տրանսկրիպցիոն եղանակով կարգավորում է այս ISG-ների արտահայտումը, սակայն դրա փոխազդեցությունը ISG-ների հետ սպիտակուցի մակարդակով չի ուսումնասիրվել:STAT1-ի բյուրեղային կառուցվածքը ցույց է տվել, որ նրա պտուտակավոր տիրույթը (CCD) չի մասնակցում ԴՆԹ-ի կամ պրոտոմերների հետ փոխազդեցությանը դիմերների ձևավորման ժամանակ35:Այս α-պտուտակները կազմում են պարուրաձև պարուրաձև կառուցվածք, որն ապահովում է հիմնականում հիդրոֆիլ մակերեսը փոխազդեցությունների առաջացման համար 35:Մեր CLMS տվյալների մեջ մենք նկատեցինք, որ STAT1-ի հետ փոխազդեցությունների մեծ մասը տեղի է ունեցել SH2 տիրույթում, որը նախորդում է CCD-ին, կապող տիրույթին կամ C-տերմինալ պոչին (մնացորդներ 700-708) (Նկար 4Ա):Նախորդ ուսումնասիրությունը հայտնում էր, որ USP18-ը կապվում է STAT2-ի CCD և ԴՆԹ-կապող տիրույթին (DBD) և հավաքագրվում է I տիպի ինտերֆերոնային ընկալիչի IFNAR2 ենթամիավորում՝ միջնորդելու I տիպի ինտերֆերոնի ազդանշանային արգելակումը 24:Մեր տվյալները նաև ցույց տվեցին, որ USP18 կատալիտիկ տիրույթը փոխազդում է STAT1 DBD-ի հետ (Նկար 4A,D)՝ ենթադրելով, որ և՛ STAT1-ը, և՛ STAT2-ը կարող են դեր խաղալ USP18-ը IFNAR2-ին ներգրավելու հարցում:
Սպիտակուց-սպիտակուցային ISG ցանցը հայտնաբերվել է IFNα-ով մշակված խաչաձեւ կապակցված բջիջներում:(A) 2D փոխազդեցության գծապատկեր, որը ցույց է տալիս սպիտակուցի և սպիտակուցի փոխազդեցությունը (ստեղծվել է SIM-XL ծրագրում), միջմոլեկուլային փոխազդեցությունները ներկայացնող գծերով (խաչաձև կապի անջատումը սահմանված է 3.5):Տարբեր ինքնության տիրույթները նշվում են իրենց գույնով32՝ MX1 տիրույթ, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) և GED (569–660)։OAS3 տիրույթներ՝ OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) և OAS1_C (903-108):Դոմեն ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) և fn3 (777–864)։STAT1 դաշտեր՝ STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) և STAT1_TAZ2bind (715–739)։(B) Խաչաձև կապակցված սպիտակուցների (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 և STAT1) շրջանաձև դիտիչ՝ համապատասխանաբար կապույտ և կարմիր գույներով պիտակավորված փոխազդեցություններով և փոխազդեցություններով:Խաչաձեւ կապի շեմը սահմանվել է 3,5:Կետային գծապատկերները ցույց են տալիս STAT1 փոխազդեցության վայրերը MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) և OAS3 (F), ինչպես նաև K կամ S փոխազդեցության վայրերը երկու պեպտիդների միջև:Նկարում խաչաձեւ կապի միավորի շեմը սահմանվել է 3.0:(G) STAT1 և OAS3 DI տիրույթների միջև փոխազդեցության տարբեր վայրեր, որոնք դրված են PyMol-ում իրենց սպիտակուցային կառուցվածքների վրա (PyMOL մոլեկուլային գրաֆիկական համակարգ, տարբերակ 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id՝ 1bf533) և OAS3 (pdb id՝ 4s3n34):) ծրագիր։
Մարդկանց մոտ նկարագրվել են USP18-ի երկու իզոֆորմներ՝ ամբողջ երկարությամբ սպիտակուց, որը հիմնականում տեղակայված է միջուկում, և իզոֆորմ առանց N-տերմինալ տիրույթի՝ USP18-sf, որը հավասարաչափ բաշխված է ցիտոպլազմայում և միջուկում 36:Բացի այդ, կանխատեսվում էր, որ N-վերջնամասը անկառուցվածք է և չի պահանջում իզոպեպտիդազի ակտիվություն կամ ISG1537 կապ:Մեր ուսումնասիրության մեջ հայտնաբերված փոխազդեցությունների մեծ մասը գտնվում էր սպիտակուցի N-վերջում, ինչը ենթադրում է, որ այդ փոխազդեցությունները ներառում են ամբողջ երկարությամբ USP18 (Նկար 4A,D) և, հետևաբար, հավանաբար տեղի են ունենում միջուկում:Ավելին, մեր տվյալները ցույց են տալիս նաև, որ N-տերմինալը մասնագիտացված է սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցության համար:IFNAR2-ի կապակցման վայրը գտնվում է 312-368 մնացորդների միջև, և հատկապես, համալիրի սպիտակուցներից ոչ մեկը չի կապվում այս շրջանին (նկ. 4Ա) 37,38:Այս տվյալները միասին վերցրած ցույց են տալիս, որ IFNAR2 կապող տիրույթը բացառապես օգտագործվում է ընկալիչի սպիտակուցի կողմից:Բացի այդ, հայտնաբերվել է միայն OAS3-ը և ROBO1-ը, որոնք կապված են N-տերմինալի և IFNAR2 կապող տեղամասի վերև գտնվող տիրույթների հետ (Նկար 4Ա):
ROBO1-ը պատկանում է տրանսմեմբրանային ազդանշանային մոլեկուլների իմունոգոլոբուլինների (Ig) գերընտանիքին և բաղկացած է հինգ Ig տիրույթներից և երեք ֆիբրոնեկտինի (Fn) տիրույթներից արտաբջջային շրջանում։Այս արտաբջջային տիրույթներին հաջորդում է թաղանթային-մոտակա շրջանը և մեկ տրանսմեմբրանային պարույր 39: Չկառուցված ներբջջային շրջանը գտնվում է C-վերջում և պարունակում է պահպանված հաջորդականության մոտիվներ, որոնք միջնորդում են էֆեկտորային սպիտակուցի կապը39:~1100-ից մինչև 1600 ամինաթթուներից տարածվող շրջանը հիմնականում խանգարված է:Մենք պարզեցինք, որ MX1-ը փոխազդում է ROBO1-ի հետ Ig, Fn և ներբջջային տիրույթների միջոցով, մինչդեռ STAT1-ի հետ փոխազդեցությունների մեծ մասը տեղի է ունենում նրա CCD-ի, կապող տիրույթի և ROBO1-ի C-վերջնակի միջև (նկ. 4A,E):Մյուս կողմից, DI, DIII և OAS3 կապող շրջանների հետ փոխազդեցությունները բաշխվել են ROBO1 սպիտակուցի ողջ տարածքում (նկ. 4Ա):
Օլիգոադենիլատ սինթազա (OAS) սպիտակուցների ընտանիքը ընդունում և կապում է ներբջջային երկշղթա ՌՆԹ (dsRNA), ենթարկվում կոնֆորմացիոն փոփոխությունների և սինթեզում է 2',5' կապված օլիգոադենիլատներ (2-5 As) 40:Պարզվել է, որ երեք OAS-ներից OAS3-ն ամենաբարձր հարաբերակցությունն է ցուցաբերում dsRNA-ի նկատմամբ և սինթեզում է 2-5 As-ի նվազագույն քանակությունը, որը կարող է ակտիվացնել RNase L-ն և դրանով իսկ սահմանափակել վիրուսային վերարտադրությունը41:OAS ընտանիքը բաղկացած է պոլիմերազային բետա (pol-β) նման նուկլեոտիդ տրանսֆերազային տիրույթներից։Նախորդ հետազոտությունները ցույց են տվել, որ C-տերմինալ տիրույթի (DIII) կատալիտիկ ակտիվությունը կախված է dsRNA կապող տիրույթից (DI), որն անհրաժեշտ է OAS342-ի ակտիվացման համար:Մենք նկատեցինք, որ OAS3-ի DI և DII տիրույթները փոխազդում են CCD-ի և SH2-ի և STAT1 TAD-ի միջև փոքր միացման շրջանի հետ (Նկար 4A,F):Սպիտակուցի կառուցվածքի վրա խաչաձև կապող տարբեր վայրերի ծածկումը բացահայտեց β-թերթի և DBD STAT1 հանգույցի և OAS3-ի DI տիրույթում 60-75 մնացորդներից ձևավորված բաց գրպանի կամ խոռոչի միջև փոխազդեցություն (նկ. 4G):Կոմպլեքսում սպիտակուցների կողմնորոշումը ցույց տվեց նաև, որ OAS3-ի հետ ոչ մի փոխազդեցություն չի խանգարում նրա DI տիրույթի ԴՆԹ-ի հետ կապելու կարողությանը (նկ. S1A):Բացի այդ, GTPase MX1-ի N-տերմինալ տիրույթը լայնորեն փոխազդում է OAS3-ի DI և DIII տիրույթների հետ (նկ. 4Ա):Մենք նաև նկատեցինք փոխազդեցություն OAS1-ի և MX1-ի միջև IFNα-ով մշակված բոլոր երեք կրկնություններում, որտեղ մեկ OAS1 տիրույթ (նաև կատալիտիկորեն ակտիվ) փոխազդում էր բոլոր երեք MX1 տիրույթների հետ (Նկար S2A,B):
MX սպիտակուցները դինեինանման GTPase-ների մեծ ընտանիքի մաս են կազմում, որոնք պարունակում են N-տերմինալ GTPase տիրույթ, որը կապում և հիդրոլիզացնում է GTP-ն, միջանկյալ տիրույթ, որը միջնորդում է ինքնակազմակերպումը, և C-տերմինալ լեյցինի կայծակաճարմանդ, որը գործում է որպես GTPase (LZ )տիրույթի էֆեկտոր տիրույթ25,43.MX1-ը կապվում է վիրուսային պոլիմերազների ենթամիավորների հետ՝ արգելափակելու վիրուսային գենի տրանսկրիպցիան43:Նախկինում հաղորդված խմորիչի երկու հիբրիդային էկրանը ցույց է տվել, որ PIAS1-ի հետ կապված MX1-ն արգելակում է STAT1-ի միջնորդավորված գենի ակտիվացումը՝ արգելափակելով ԴՆԹ-ի կապակցման ակտիվությունը և ունի նաև SUMO E344,45 լիգազի ակտիվություն:Այստեղ մենք ցույց ենք տալիս, որ MX1-ը կապվում է STAT1-ին (Նկար 4C,D), սակայն, թե ինչպես է այս փոխազդեցությունն ազդում STAT1-ով միջնորդավորված գենի ակտիվացման վրա՝ ի պատասխան IFNα-ի, կարիք ունի հետագա ուսումնասիրության:Բացի այդ, մենք նաև պարզեցինք, որ MX1-ը փոխազդում է IFIT3-ի և DDX60-ի հետ IFNα-ով բուժված բոլոր երեք կրկնություններում (նկ. S2C):
DDX60-ը IFN-ով առաջացած ցիտոպլազմային հելիկազան է, որը նախկինում հաղորդվել էր, որ դեր է խաղում վիրուսային RNA46-ի RIG-I-ից անկախ դեգրադացիայի մեջ:Այն փոխազդում է RIG-I-ի հետ և ակտիվացնում է դրա ազդանշանը լիգանդի հատուկ ձևով: 46. DDX60-ը բաղկացած է DEXD/H-Box հելիկազի տիրույթից և C-տերմինալ հելիկազի տիրույթից, որը կապում է վիրուսային ՌՆԹ-ն և ԴՆԹ-ն47:Նրա փոխազդեցությունների մեծ մասը MX1-ի և IFIT3-ի հետ տեղի է ունենում երկար N- և C-տերմինալ շրջաններում՝ առանց կանոնական տիրույթների կամ մոտիվների (նկ. S2E,F):Այնուամենայնիվ, MX1-ը նույնպես կապված է DEXD/H-Box հելիկազի տիրույթի հետ (նկ. S2E):IFIT ընտանիքի սպիտակուցներն ունեն պարուրաձև շրջադարձային պարույրի տարբերակիչ մոտիվի կրկնօրինակներ, որը կոչվում է տետրապեպտիդային կրկնություն (TPR):Պարզվել է, որ IFIT3-ը RIG-I ազդանշանի դրական մոդուլատոր է և, հետևաբար, MAVS համալիրի բաղադրիչ:Միասին մեր տվյալները ցույց են տալիս, որ IFIT3-ը և DDX60-ը հիմնականում փոխազդում են IFIT3-ի TPR 3–6-ի միջև ընկած շրջանում և կարող են դեր խաղալ RIG-I/MAVS ազդանշանային ազդանշանում (նկ. S2F):
Հաշվի առնելով, որ ամբողջ պրոտեոմի զննումն հաշվողականորեն ինտենսիվ է, մենք այնուհետև ստուգեցինք մարդկային UniProt տվյալների բազան՝ IFNα-ով բուժվող կրկնություններից մեկի առկայության համար:Այս կրկնօրինակում մենք գտանք մի քանի բարձր հուսալի փոխազդեցության ցանցեր HLA-A-ի համար:MS/MS սպեկտրներով հայտնաբերված սպիտակուցային ուղիների վերլուծությունը ցույց է տվել, որ MHC-I-ի վրա հիմնված անտիգենի մշակումը և ներկայացումը ինտերֆերոնի կողմից հրահրվող հիմնական ուղին է (նկ. 3D):Հետևաբար, մենք կենտրոնացել ենք MHC-I մոլեկուլների սպիտակուցային փոխազդեցությունների ուսումնասիրության վրա՝ վստահության բարձր աստիճանով բոլոր խաչաձև կապակցված նմուշներում:HLA-ն բաղկացած է α1, α2 և α3 տիրույթներից և թեթև շղթաներից, իսկ միկրոգլոբուլինը β2 (β2m) մշտական ​​կապերոնային սպիտակուց է49:Էնդոպլազմիկ ցանցում հավաքվելուց հետո HLA-ն անկայուն է պեպտիդային լիգանդների բացակայության դեպքում50:Պեպտիդ կապող ակոսը ձևավորվում է բարձր պոլիմորֆ և չկառուցված α1 և α2 տիրույթներով ոչ պեպտիդային ձևով և համեմատաբար ավելի քիչ պոլիմորֆ α351 տիրույթով:IFNα-ի առկայության դեպքում մենք հայտնաբերեցինք երկու HLA-A համալիրներ. մեկը փոխազդում է HMGA1-ի և H2B-ի հետ (Նկար 5, Աղյուսակ S3), իսկ մյուսը փոխազդում է MDN1, LRCH4 և H2B-ի հետ (Նկար 6):
IFNα-ն առաջացնում է HLA-A փոխազդեցության ցանց H2B (H2BFS) և HMGA1-ի հետ:(A) 2D սյուժեն (ստեղծվել է SIM-XL ծրագրաշարում), որը պատկերում է տարբեր տեսակի փոխազդեցություններ H2B-HLA-A-HMGA1 համալիրում. փոխկապակցում (կապույտ), փոխկապակցում (կարմիր) և մեկ հղում (սև):.Տարբեր ինքնության տիրույթները գունավոր կոդավորված են32՝ H2B (հիստոն; 2–102) և MHC-I (MHC_1; 25–203, խումբ C1; 210–290 և MHC_I_C; 337–364):Խաչաձեւ կապի շեմը սահմանվել է 3,5:Կետային գծապատկերները ցույց են տալիս HLA-A փոխազդեցության վայրերը H2B (B) և HMGA1 (C) հետ, ինչպես նաև K կամ S փոխազդեցության վայրերը երկու պեպտիդների միջև:Նկարում խաչաձեւ կապի միավորի շեմը սահմանվել է 3.0:(D) PyMOL ծրագրի H2B, HLA-A և HMGA1 սպիտակուցների կառուցվածքներում ցուցադրված սպիտակուցների միջև փոխհարաբերությունները:Այս կառուցվածքները մոդելավորվել են Phyre2 սերվերի միջոցով (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) և H2B, HLA-A և HMGA1 սպիտակուցների ձևանմուշների կառուցվածքները համապատասխանաբար եղել են 1kx552, 1kj349 և 2eze55:
IFNα-ն առաջացնում է HLA-A փոխազդեցության ցանց H2B (H2BFS), MDN1 և LRCH4-ի հետ:(A) Ներմոլեկուլային (կարմիր) և միջմոլեկուլային (կապույտ) խաչաձև կապեր, որոնք ներկայացված են 2D ինտերակտիվ քարտեզի վրա (ստեղծվել է SIM-XL ծրագրաշարում), MDN1-ով ներկայացված է շրջանագծի տեսքով:Խաչաձեւ կապի շեմը սահմանվել է 3,5:Տարբեր ինքնության տիրույթները գունավոր կոդավորված են32՝ H2B (հիստոն; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, խումբ C1; 210–290 և MHC_I_C; 337–364) և LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) և CH (535–641)):(B) PyMOL ծրագրի H2B, HLA-A, LRCH4 և MDN1 սպիտակուցների կառուցվածքներում ցուցադրված սպիտակուցների միջև փոխհարաբերությունները:Այս կառուցվածքները մոդելավորվել են Phyre2 սերվերի միջոցով (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) 1kx552, 1kj349, 6hlu62 և 6i2665 ձևանմուշների կառուցվածքներով H2B, HLA-A, LRCH4 և MDN1 սպիտակուցների համար, համապատասխանաբար.Կետային գծապատկերներ, որոնք ցույց են տալիս HLA-A-ի K կամ S փոխազդեցության վայրերը H2B (C), LRCH4 (D) և MDN1 (E) հետ:Հողամասերի համար խաչաձև կապի միավորի շեմը սահմանվել է 3.0:
Բացի գենոմի ամբողջականությունը պահպանելուց, հիստոն H2B-ը նաև մասնակցում է տրանսկրիպցիայի կարգավորմանը։H2B սպիտակուցը բաղկացած է կենտրոնական հիստոնային տիրույթից (HFD), որը ձևավորվում է երեք α-պարույրներով, որոնք բաժանված են օղակներով և C-վերջնական պոչով 41,52:H2B-ի հետ փոխազդեցության մեծ մասը տեղի է ունենում α1 պարույրում, որն ապահովում է տրիմերացում HFD հետերոդիմերի հետ (նկ. 5A,B):Չնայած լիզինները ներգրավված են ԴՆԹ-ի միացման մեջ, որոշ լիզիններ նաև այլընտրանքային ացետիլացման կամ մեթիլացման տեղամասեր են:Օրինակ, H2B-ից K43, K46 և K57 մնացորդները ներգրավված չեն ԴՆԹ-ի ուղղակի կապի մեջ, բայց հանդիսանում են տարբեր հետտրանսկրիպցիոն փոփոխությունների թիրախ53:Նմանապես, K44, K47 և K57 մնացորդները H2B-ում կարող են այլընտրանքային դեր խաղալ IFNα-ի առկայության դեպքում, ներառյալ այլ սպիտակուցների հետ փոխազդեցությունները (նկ. 5A, B):Բացի այդ, արտաքրոմոսոմային հիստոն H2B-ն ակտիվացնում է իմունային պատասխանը տարբեր տեսակի բջիջներում՝ հանդես գալով որպես ցիտոզոլային սենսոր՝ հայտնաբերելու վարակիչ նյութերից կամ վնասված բջիջներից ստացված երկշղթա ԴՆԹ (dsDNA) բեկորները54:ԴՆԹ վիրուսների առկայության դեպքում H2B-ի սպառումը արգելակել է IFN-β արտադրությունը և STAT154 ֆոսֆորիլացումը:Հայտնի է նաև, որ H2B-ն միջուկից ներս և դուրս է գալիս ավելի արագ, քան մյուս հիմնական հիստոնները54:H2B-ի փոխազդեցությունները MDN1-ի և LRCH4-ի հետ նույնպես նկատվել են ընտրված չմշակված նմուշներում:Մենք պարզեցինք, որ HLA-A-ն փոխազդում է H2B-ի հետ IFNα-ով մշակված բոլոր երեք նմուշներում և մեկ չմշակված կրկնվող նմուշում:Այս տվյալները արտացոլում են H2B-ի դերը այլընտրանքային ֆիզիոլոգիական ֆունկցիայի մեջ՝ անկախ տրանսկրիպցիոն կարգավորումից:
HMGA1 (բարձր շարժունակության խումբ AT-Hook 1), փոքր նուկլեոպրոտեին, որը հարուստ է հիվանդություններին նպաստող ամինաթթուներով, հայտնաբերվել է HLA-A-ի հետ համատեղ:Այն ունի թթվային C-տերմինալ պոչ և երեք հստակ DBD, որոնք կոչվում են AT կեռիկներ, քանի որ դրանք կապվում են dsDNA55,56-ում AT հարուստ շրջանի փոքր ակոսին:Այս կապը հանգեցնում է ԴՆԹ-ի թեքմանը կամ ուղղմանը, ինչը թույլ է տալիս կանոնական տառադարձման գործոններին մուտք գործել դրա համաձայնության հաջորդականությունը:Ենթադրվում է, որ C-տերմինալի պոչը ներգրավված է սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցությունների և տրանսկրիպցիոն գործոնների հավաքագրման մեջ, քանի որ C-տերմինալի ջնջման մուտանտները չեն կարողանում սկսել տրանսկրիպցիան57:Ավելին, այս տիրույթը պարունակում է մի քանի պահպանված ֆոսֆորիլացման տեղամասեր, որոնք հայտնի են կինազների սուբստրատներ 58:Մենք դիտարկել ենք HLA-A և H2B փոխազդեցությունները HMGA1-ի հետ C-տերմինալ տիրույթից դուրս՝ ենթադրելով, որ C-տերմինալ տիրույթը հիմնականում օգտագործվում է տրանսկրիպցիոն գործոնը կապելու համար (նկ. 5A, C):HMGA սպիտակուցները մրցում են հիստոն H1-ի հետ՝ ադապտեր ԴՆԹ-ի հետ կապվելու համար՝ դրանով իսկ բարձրացնելով հասանելիությունը57:Նմանապես, հավանական է թվում, որ HMGA-ն փոխազդում է հիստոն H2B-ի հետ կապող ԴՆԹ-ի երկայնքով՝ մրցակցելով հիստոն H1-ի հետ:HMGB1-ն առաջացնում է HLA-A, -B և -C-ի արտահայտումը դենդրիտային բջիջներում, ինչը հանգեցնում է դրանց ակտիվացման59, սակայն HMG-ի և HLA-ի փոխազդեցությունը նախկինում չի հաղորդվել:Մենք պարզեցինք, որ HMGA1-ը փոխազդում է HLA-A-ի α1 և α3 տիրույթների հետ, իսկ փոխազդեցությունների մեծ մասը՝ իր 3 DBD-ից դուրս (Նկար 5A,C):Մեր ձեռքերում պարզվել է, որ HLA-A-ն տեղայնացված է միջուկում (տվյալները ցույց չեն տալիս), և հաշվի առնելով, որ H2B-ն և HMGA1-ը նույնպես առկա են միջուկում, այս փոխազդեցությունը, հավանաբար, տեղի է ունենում միջուկում:H2B-ի, HLA-A-ի և HMGA1-ի միջև չափված հատուկ հավելումներ ներկայացված են Նկար 5D-ում:
HLA-A-ի փոխազդեցությունների մեծ մասը այլ սպիտակուցների հետ տեղի է ունենում նրա α1 և α2 տիրույթներում և խանգարված C-տերմինալ տիրույթում (նկ. 6):Այս օրինակներից մեկում մենք պարզեցինք, որ HLA-A-ն փոխազդում է LRCH4-ի խանգարված N-տերմինալ պոչի հետ (Նկար 6A,D):LRCH4-ը կարգավորում է TLR4-ի ակտիվացումը և LPS ցիտոկինի ինդուկցիան՝ դրանով իսկ մոդուլավորելով բնածին իմունային պատասխանը60,61:Այն թաղանթային սպիտակուց է՝ ինը լեյցինով հարուստ կրկնություններով (LRRs) և կալմոդուլինի (CH) հոմոլոգիայի մոտիվով իր էկտոդոմեյնում, որին հաջորդում է տրանսմեմբրանային տիրույթը (TMD) 60, 62:Հաղորդվել է, որ CH տիրույթները միջնորդում են սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցությունները 60:LRR և CH տիրույթների միջև մոտ 300 ամինաթթուների հատվածը համեմատաբար հասանելի է, բայց խանգարված:Հիմնվելով խանգարված շրջանների՝ որպես սպիտակուցային-սպիտակուցային ցանցերի և վեզիկուլյար տրանսպորտի միջնորդների ֆունկցիայի վրա 63, մենք պարզեցինք, որ սպիտակուցների փոխազդեցությունների մեծ մասը տեղի է ունենում խանգարված շրջաններում:MDN1-ի հետ փոխազդեցությունները բաշխվել են սպիտակուցի ողջ երկարությամբ, ներառյալ LRR1, LRR6, CH տիրույթները և պատահական շրջանները, մինչդեռ H2B-ը հիմնականում կապված է CH տիրույթի հետ (նկ. 6A, B):Հատկանշական է, որ փոխազդեցություններից և ոչ մեկը չի ներառում TMJ-ը, ինչը հուշում է CLMS մոտեցման առանձնահատկությունը (Նկար 6Ա, Բ):
MDN1-ը նաև հայտնաբերվել է որպես HLA-A սպիտակուցային ցանցի մաս (Նկար 6Ա):Այն պատկանում է AAA սպիտակուցների ընտանիքին (ATPases, որոնք կապված են տարբեր գործունեության հետ):Սա նույն N-տերմինալային AAA տիրույթն է, որը կազմակերպվում է վեցամերիկ օղակի մեջ և հեռացնում հավաքման գործոնը 60S 64 ռիբոսոմային ենթամիավորից:կարծես նման է dynein64,65,66-ին:Բացի այդ, Asp/Glu հարուստ տարածաշրջանին հաջորդում է MIDAS տիրույթը (մետաղական իոնային կախված տեղամաս):Շնորհիվ MDN1-ի մեծ չափերի (մոտ 5600 ամինաթթու) և լավ ուսումնասիրված սպիտակուցների հետ նրա սահմանափակ հոմոոլոգիայի, մարդկանց մոտ դրա կառուցվածքի և գործառույթի մասին քիչ բան է հայտնի:Մենք հայտնաբերեցինք HLA-A, H2B և LRCH4 որպես MDN1 կապող գործընկերներ և բացահայտեցինք նրանց կողմնորոշումը որպես սպիտակուցային համալիրներ PyMol-ում (նկ. 6A,B):Այս երեք սպիտակուցները փոխազդում են AAA տիրույթի, dynein-ի նման կապող տիրույթի և, հնարավոր է, MIDAS MDN1 տիրույթի հետ։Նախորդ զեկույցում խայծի սպիտակուցների մերձեցման մաքրումը MDN1-ը նույնացրել է որպես հիստոն H2B67-ի հետ կապված սպիտակուց:Ի հավելումն, վերջերս կատարած ուսումնասիրությունը նաև հաղորդում է MDN-ի և HLA-B-ի փոխազդեցության մասին HCT116 բջիջներում՝ օգտագործելով մերձեցված զանգվածային սպեկտրոմետրիա՝ աջակցելով մեր բացահայտումներին68:Այս համալիրի նույնականացումը IFNα-ով մշակված նմուշներում հուշում է MDN1-ի դերը ինտերֆերոնի ազդանշանման մեջ:
Քանի որ HLA գեները խիստ պոլիմորֆ են, մենք արդյունահանել ենք HLA-A, -B և -C քարտեզագրման հաջորդականության ընթերցումները Flo-1 բջիջների ՌՆԹ-ի հաջորդականության տվյալներից (տվյալները ցուցադրված չեն):Պեպտիդների հաջորդականությունները, որոնք համահունչ են հաջորդականության ընթերցմանը, բացահայտեցին զգալի տարբերություններ HLA-A, -B և -C միջև այն շրջաններում, որտեղ խաչակցված պեպտիդները գտնվում էին HLA-A-ում (Նկար S3):Բացի այդ, մենք չնկատեցինք HLA-B/C մոլեկուլների սպիտակուցից սպիտակուցի խաչաձեւ կապը H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 սպիտակուցների հետ:Սա ենթադրում է, որ HLA-A-ի, MDN1-ի, LRCH1-ի և HMGA1-ի միջև հայտնաբերված սպիտակուցային փոխազդեցությունը հատուկ է HLA-A-ին:Բացի այդ, չխաչ կապված նմուշների պրոտեոմիկ անալիզը (Աղյուսակ S4) ցույց է տվել, որ HLA-A-ն ունի հաջորդականության ավելի բարձր ծածկույթ՝ համեմատած HLA-B-ի կամ HLA-C-ի:HLA-A-ի համար հայտնաբերված պեպտիդները բարձր ինտենսիվություն են ունեցել ինչպես IFNα-ով, այնպես էլ չմշակված նմուշներում:
Ապահովելու համար, որ այստեղ հայտնաբերված փոխազդեցությունները պայմանավորված չեն երկու սպիտակուցների ոչ սպեցիֆիկ խաչաձև կապով, որոնք գտնվում են տարածական հարևանությամբ, մենք հետագայում հաստատեցինք երկու նոր HLA-A փոխազդող գործոններ՝ կատարելով համատեղ իմունային նստվածքային փորձարկումներ:HLA-A փոխազդեցությունները էնդոգեն MDN1-ի և H2B-ի հետ հայտնաբերվել են ինչպես IFNα-ով բուժված, այնպես էլ չբուժված Flo-1 բջիջներում (Նկար 7, Նկար S4):Մենք հաստատեցինք, որ HLA-A-ն ֆիքսված է H2B-ով իմունային նստվածքներում, և որ այս կապը պայմանավորված է IFNα բուժման հետ, քանի որ HLA-A-ն բացակայում էր չմշակված բջիջների իմունային նստվածքային նմուշներում (Նկար 7Ա):Այնուամենայնիվ, մեր տվյալները ցույց են տալիս, որ IFNα-ն տարբեր կերպով կարգավորում է HLA-A-ի կապը H2B-ի և MDN1-ի հետ:IFNα-ն առաջացնում է կապ H2B-ի և HLA-A-ի միջև, բայց նվազեցնում է դրա կապը MDN1-ի հետ:Մենք պարզեցինք, որ MDN1-ը կապված է HLA-A-ի հետ հսկիչ սարքերում, և IFNα-ի ավելացումը նվազեցրեց այս փոխազդեցությունը՝ անկախ IFNα-ի կողմից MDN1 ինդուկցիայից (Նկար 7B,C):Բացի այդ, HLA-A իմունային նստվածքը գրավեց H2B-ն A549 բջիջներում (նկ. S4), ինչը ենթադրում է, որ այս փոխազդեցությունը բջիջների տեսակից անկախ է:Միասին այս արդյունքները հաստատում են HLA-A-ի ինտերֆերոնի միջնորդավորված փոխազդեցությունները H2B-ի և MDN1-ի հետ:
HLA-A-ն համատեղ մաքրում է H2B-ն և MDN1-ը:Ներկայացուցչական էնդոգեն H2B (A) և MDN1 (B) իմունոբլոտները իմունոպրեցիպտացվել են IFNα-ով մշակված Flo-1 բջիջներից և հետազոտվել նշված հակամարմինների համար:Որպես բացասական հսկողություն օգտագործվել է մկան և նապաստակի IgG:(C) Տարբեր անտիգենների հարաբերական քանակները (ներածումը) պատկերված են նշված հակամարմինների դեմ զոնդավորված իմունոբլոթերով, β-ակտինը օգտագործվել է որպես բեռնման հսկողություն:
Հետազոտվել են ինտերֆերոնից առաջացած բարձր հուսալի խաչաձեւ կապակցված ցանցերից մեկի՝ H2B-HLA-A-HMGA1-ի կառուցվածքային հատկությունները:Մենք օգտագործեցինք մոլեկուլային դինամիկայի մոդելավորումը որպես այլընտրանքային մոտեցում՝ հասկանալու այս համալիրում ներգրավված սպիտակուցների կոնֆորմացիոն դինամիկան (Նկար 8):CLMS-ի տվյալներից ստացված եզրակացությունները ցույց են տալիս H2B, HLA-A և HMGA1 սպիտակուցների տարբեր կոնֆորմացիաների հնարավորությունը:Հետևաբար, լուծիչ միջավայրում մոդելավորվել են հետևյալ պոտենցիալ համալիրները՝ H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A և H2B-HLA-A-HMGA1:Նախնական սպիտակուց-սպիտակուց միացման էկրանը՝ օգտագործելով MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Մոնրեալ, Քվեբեկ, Կանադա) փաթեթը առաջարկել է հնարավոր կոնֆորմացիաներ, որոնք տարբերվում են այս սպիտակուցների միջև (նկ. 8Ա):Դոկինգ սպիտակուցային համալիրի պատկերացումը բացահայտեց մի քանի փոխազդեցություններ և հնարավոր կոնֆորմացիաներ (Նկար 5Ա, 8):Այսպիսով, հնարավոր կոնֆորմացիաներից մեկը ներկայացված է Նկար 8Ա-ում (պիտակավորված խաչաձև կապերով) և այն հետագայում գնահատվել է MD մոդելավորման խողովակաշարի միջոցով:Բացի այդ, H2B-ի կամ HMGA1-ի կապումը HLA-A-ին ընդգծում է H2B-ի ավելի բարձր մերձեցումը HLA-A-ի նկատմամբ (նկ. 8Ա):
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A և H2B-HLA-A-HMGA1 համալիրների միջև հնարավոր ցանցերի կոնֆորմացիոն դինամիկան:(A) Ձախ վահանակը ներմոլեկուլային (կարմիր) և միջմոլեկուլային (կապույտ) խաչմերուկների 2D քարտեզ է (ստեղծվել է SIM-XL ծրագրաշարում) (խաչաձև կապի կտրվածքը սահմանված է 3.5):Բացի այդ, խաչաձև կապող մնացորդները պիտակավորված են H2B, HLA-A և HMGA1 սպիտակուցների կառուցվածքների վրա:Այս սպիտակուցների հարակից կոնֆորմացիաները արդյունահանվել են՝ օգտագործելով MOE փաթեթում ներդրված միացվող խողովակաշարը:Ներքևի ձախ վահանակը ցույց է տալիս H2B-HLA-A և HMGA1-HLA-A բարդույթների տարբեր հնարավոր կոնֆորմացիաները՝ սպիտակուց-սպիտակուց կապող տարբեր կապերով (GBVI/WSA dG; կկալ/մոլ):(B) ատոմային դիրքերի ստանդարտ շեղում (RMSD) (բացառությամբ ջրածնի ատոմների) յուրաքանչյուր սպիտակուցի կառուցվածքի համար:(C) Միջմոլեկուլային սպիտակուց-սպիտակուց ջրածնային կապի փոխազդեցությունները տարբեր մոդելավորված համալիրներից՝ հաշվի առնելով ≥ 10 ns տևողությամբ հատուկ փոխազդեցությունները:h-պարտատոմսերի դոնոր-ընդունիչ անջատման հեռավորությունը սահմանվել է 3,5 Å, իսկ դոնոր-H-ընդունիչի անջատման անկյունը՝ ≥ 160°–180°:(D) պիտակավորված մնացորդներ, որոնք ստեղծում են HLA-A սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցություն իրենց համապատասխան գործընկերների հետ, որոնք ընդգրկում են ≥ 20 ns, արդյունահանված կեղծ HLA-A-H2B և HLA-A-HMGA1 համալիրներից:Սպիտակուցային կառուցվածքները ներկայացնում են 100 ns MDS միջին կառուցվածք:(E) HLA-A-H2B և HLA-A-HMGA1 կոմպլեքսների միջև փոխազդեցությունները՝ համեմատած 100 ns-ի ընթացքում H2B-HLA մոդելավորման միջոցով հետևված փոխազդեցությունների հետ՝ հիմնված երկու պեպտիդների միջև K կամ S փոխազդեցության վայրի վրա:Կոմպլեքսներ /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Խաչաձև կապերի գնահատման շեմային արժեքը սահմանվել է 3.0, և հաշվի են առնվել հատուկ փոխազդեցությունները MDS-ից՝ ≥ 10 ns:Սպիտակուցի կառուցվածքները վիզուալացվել են՝ օգտագործելով BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) և Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Մոնրեալ, Քվեբեկ, Կանադա) փաթեթները:
HLA-A մոլեկուլների կայունությունը ժամանակի ընթացքում (ստանդարտ շեղում; RMSD կամ ստանդարտ շեղում; RMSF) ցույց է տվել, որ H2B կամ HMGA1 սպիտակուցների առկայությունը համալիրներում կայունացրել է HLA-A-ն (Նկար 8B, Նկար S5):HMGA1 սպիտակուցը սերտորեն կապվում է HLA-A-ի B2M տեղամասի հետ՝ առաջացնելով HLA-A ամինաթթուների կայունությունը HLA-A-HMGA1 կամ H2B-HLA-A-HMGA1 համալիրում (Նկար 8B, Նկար S5):Մասնավորապես, HLA ~60-90 և ~180-210 մնացորդները հայտնաբերվել են ավելի քիչ ճկուն H2B-ի առկայության դեպքում (Նկար 8B):H2B-ը և HMGA1-ը H2B-HLA-A-HMGA1 համալիրում ավելի լավ կապ են ցույց տվել HLA-A-ի հետ՝ համեմատած HLA-A-ի հետ միայն H2B-ի կամ HMGA1-ի հետ (Նկար 8C,D; Աղյուսակ S5):Ջրածնային կապում ներգրավված մնացորդները (MD մոդելավորված բարձր զբաղվածություն ≥ 10 ns) համընկնում են CLMS փոխազդեցության վայրերի հետ (K կամ S մնացորդներ) համալիրում, ինչը ենթադրում է, որ CLMS-ի կողմից բացահայտված փոխազդեցությունները շատ հուսալի են:Հուսալիություն (նկ. 8E ):CLMS և MD մոդելավորման ժամանակ հայտնաբերվել է HLA-A մնացորդներ մոտ 190-210 և մոտ 200-220 ամինաթթուների միջև, որոնք կապում են համապատասխանաբար H2B և HMGA1 (Նկար 8E):
Սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցությունները ձևավորում են դինամիկ կառուցվածքային ցանցեր, որոնք միջնորդում են ներբջջային հաղորդակցությունը՝ ի պատասխան որոշակի գրգռիչների:Քանի որ պրոտեոմիկայի շատ մոտեցումներ հայտնաբերում են սպիտակուցի ընդհանուր կայուն մակարդակի փոփոխությունները, սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցության դինամիկան պահանջում է լրացուցիչ գործիքներ՝ կապող միջերեսները գրավելու համար, և CLMS-ը այդպիսի գործիքներից մեկն է:Ինտերֆերոնի ազդանշանային համակարգը ցիտոկինային ցանց է, որը թույլ է տալիս բջիջներին արձագանքել շրջակա միջավայրի պաթոգեն և ներքին պաթոլոգիական ազդանշանների մի շարք, որոնք ավարտվում են ինտերֆերոն-ինդուկտիվ պրոտեինների ենթաբազմություններով:Մենք կիրառեցինք CLMS՝ որոշելու համար, թե արդյոք նոր սպիտակուց-սպիտակ փոխազդեցությունները կարող են հայտնաբերվել ինտերֆերոնից առաջացած սպիտակուցների վահանակի մեջ:Սպիտակուցների խաչաձեւ կապի գլոբալ վերլուծությունը ինտերֆերոնին արձագանքող Flo-1 բջիջների մոդելում օգտագործվել է սպիտակուցային բարդույթները գրավելու համար:Տրիպտիկ պեպտիդների արդյունահանումը չխաչ կապված և խաչաձեւ կապակցված բջիջներից թույլ է տալիս պեպտիդների հաշվառում, ճանապարհի հարստացում և պեպտիդների երկարության բաշխում` սահմանված LFQ ինտենսիվությամբ:Կանոնական ինտերֆերոնով ինդուկտիվ սպիտակուցները ճանաչվել են որպես դրական ներքին հսկողություն, մինչդեռ նկատվել են կանոնական ինտերֆերոնով ինդուկտիվ պրոտեինների միջմոլեկուլային և ներմոլեկուլային խաչակցված նոր հավելումներ, ինչպիսիք են MX1, UP18, OAS3 և STAT1:Հետազոտվել են տարբեր կառուցվածքային առանձնահատկություններ և փոխազդեցություններ ֆունկցիոնալ տարածքներում:
HLA-A-ի, MDN1-ի և H2B-ի փոխազդեցությունը հայտնաբերվել է իմունոբլոթինգի միջոցով Flo-1 և A549 բջիջներում, որոնք մշակվել և չեն բուժվել IFNα-ով:Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ HLA-A-ն H2B-ի հետ միանում է IFNα-ից կախված եղանակով:Մեր աշխատանքը հետաքրքիր ճանապարհ է այս երկու համալիրների համատեղ տեղայնացման հետագա ուսումնասիրության համար:Հետաքրքիր կլինի նաև CLMS մոտեցումն ընդլայնել բջջային գծերի վահանակի վրա՝ բջիջների տիպից անկախ ինտերֆերոնի միջնորդավորված սպիտակուցային փոխազդեցությունները բացահայտելու համար:Վերջապես, մենք օգտագործեցինք MD մոդելավորումը որպես այլընտրանքային մոտեցում՝ հասկանալու H2BFS-HLA-A-HMGA1 համալիրում ներգրավված սպիտակուցների կոնֆորմացիոն դինամիկան, որը հետևում էր ներմոլեկուլային և միջմոլեկուլային խաչաձև խոսակցություններին:CLMS տվյալներից ստացված եզրակացությունները ցույց են տալիս H2BFS, HLA-A և HMGA1 սպիտակուցների տարբեր կոնֆորմացիաների հնարավորությունը:Այս միացվող սպիտակուցային բարդույթների միջև հնարավոր տարբեր համընկնումները բացահայտեցին մի քանի փոխազդեցություններ, որոնք նման են CLMS տվյալների շտեմարանում դիտվածներին:Մեր մեթոդի հիմնական ուժեղ կողմերից մեկն այն է, որ այն թույլ է տալիս հեշտությամբ նույնականացնել փոխազդող բարձր պոլիմորֆ գեները, ինչպիսին է HLA-ն, ուստի հետաքրքիր կլինի ուսումնասիրել HLA հապլոտիպային հատուկ սպիտակուցների փոխազդեցությունները, որոնք այլ կերպ դժվար է ուսումնասիրել:Միասին մեր տվյալները ցույց են տալիս, որ CLMS-ը կարող է օգտագործվել ինտերֆերոնով առաջացած ազդանշանային ցանցերի մասին մեր պատկերացումներն ընդլայնելու համար և հիմք ստեղծել ուռուցքային միկրոմիջավայրում ավելի բարդ միջբջջային համակարգերի ուսումնասիրության համար:
Flo-1 բջիջները ստացվել են ATCC-ից և պահվել DMEM-ում (Gibco)՝ համալրված 1% պենիցիլինի/ստրեպտոմիցինով (Invitrogen), 10% տավարի պտղի շիճուկով (Gibco) և պահվել 37°C և 5% CO2-ով:Ինկուբացիա.Բջիջները հասցվել են մինչև 70-80% միախառնում, նախքան IFNα14-ով մշակվելը (արտադրված է Էդինբուրգի սպիտակուցների արտադրության հաստատության կողմից):Բոլոր մյուս քիմիական նյութերն ու ռեագենտները ձեռք են բերվել Sigma Aldrich-ից, եթե այլ բան նշված չէ:
Flo-1 բջիջները մշակվել են 6 ջրհորի թիթեղներում, իսկ հաջորդ օրը բջիջները մշակվել են 10 նգ/մլ IFNα14-ով 24 ժամով մինչև մոտավորապես 80% միաձուլում:Բջիջները երեք անգամ լվացվեցին PBS-ով և միացվեցին թարմ պատրաստված DSS-ով (Thermo Fisher Scientific) (լուծված DMSO-ում) PBS-ում 5 րոպե 37°C-ում մինչև 0,5 մՄ վերջնական կոնցենտրացիան:DSS-ի խաչմերուկային ռեակցիան փոխարինվեց PBS-ով և մնացորդային DSS-ը մարվեց՝ ավելացնելով 20 մՄ Tris (pH 8.0) PBS-ում 15 րոպե 37°C-ում:Բջիջները հավաքվել են քերելով և հավաքվել ցածր կապող խողովակներում (թթվածին):
Բջջային գնդիկը լուծվել է 300 մկլ միզանյութի լիզի բուֆերի հետ (8 Մ միզանյութ, 0,1 Մ Տրիս, pH 8,5) 30 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում՝ երբեմն թափահարելով:Ցենտրիֆուգման բոլոր քայլերն իրականացվել են 14000 xg 8°C ջերմաստիճանում:Լիզատը ցենտրիֆուգեք 10 րոպե և վերին հեղուկը տեղափոխեք նոր խողովակի մեջ:Մնացած թափանցիկ մասնիկները լուծվել են 150 մկլ երկրորդ լիզի բուֆերի մեջ (2 Մ միզանյութ, 2% (վ/վ) SDS (նատրիումի դոդեցիլ սուլֆատ)) 30 րոպե կամ ավելի, մինչև ստացվի միատարր ջրային լուծույթ:Լիզատը ցենտրիֆուգվել է 20 րոպե, իսկ վերին նյութը խառնվել է նախորդ քայլում ստացված լիզատի հետ:Սպիտակուցի կոնցենտրացիան գնահատվել է Micro BCA վերլուծության միջոցով (Thermo Fisher Scientific)՝ համաձայն արտադրողի ցուցումների միկրոպլատների ընթացակարգերի համար:Նմուշները արագ սառեցվեցին հեղուկ ազոտի մեջ և պահվեցին -80°C ջերմաստիճանում:
Մոտավորապես 100 մկգ լուծվող խաչաձև կապակցված սպիտակուցը մշակվել է ֆիլտրման նմուշի պատրաստման ձևափոխված արձանագրության միջոցով (FASP), ինչպես նկարագրված է Վիշնևսկու և այլոց կողմից:69 Համառոտ, սպիտակուցը խաչաձեւ կապակցվում է 200 մկլ միզանյութի բուֆերի հետ (8 Մ միզանյութ 0,1 Մ տրիսում, pH 8,5), պտտվում և կիսով չափ կրճատվում:Ցենտրիֆուգման բոլոր քայլերն իրականացվել են 14000 xg 25°C-ում:Խաչաձև կապակցված սպիտակուցի լիզատի առաջին կեսը տեղափոխվել է 10 կԴա հզորությամբ Microcon կենտրոնախույս ֆիլտրի սարք, որը հագեցած է Ultracel-10 թաղանթով (Merck), որին հաջորդել է ցենտրիֆուգացումը ֆիլտրի վրա 25 րոպե:Այնուհետև ավելացրեք սպիտակուցի երկրորդ կեսը ֆիլտրի մեջ և կրկնեք նույն քայլերը։Սպիտակուցի վերականգնումն իրականացվել է միզանյութի բուֆերի մեջ ավելացնելով 100 մկլ 17 մՄ տրիս(2-կարբոքսիէթիլ) ֆոսֆինի հիդրոքլորիդ (TCEP):Վերականգնումը 30 րոպե 37°C-ում խառնել են 600 պտտ/րոպե արագությամբ ջերմախառնիչի վրա:Բացի այդ, սյունակը ցենտրիֆուգացվել է և կրճատված խաչաձև կապակցված սպիտակուցը ալկիլացվել է՝ օգտագործելով 100 մկլ 50 մՄ յոդոացետամիդ միզանյութի բուֆերում:Ալկիլացման ռեակցիան իրականացվել է սենյակային ջերմաստիճանում 20 րոպե մթության մեջ:Պտտեցնել սյունը, 3 անգամ լվանալ սյունակի պատերը 100 մկլ միզանյութի բուֆերով, ապա ցենտրիֆուգ անել:Նույն գործողությունը կատարվել է 3 անգամ՝ օգտագործելով 100 մկլ 100 մՄ ամոնիումի բիկարբոնատ:Նախքան տրիպսինացումը, փոխարինեք հավաքման խողովակը նորով:Ավելացրեք մարսողության բուֆեր, որը պարունակում է 50 մՄ ամոնիումի բիկարբոնատ և 1 մկլ տրիպսին՝ նոսրացված տրիփսինի բուֆերում (Promega):Տրիպսինի և սպիտակուցի հարաբերակցությունը պահպանվել է մոտ 1:33, և մարսողության ռեակցիաները ինկուբացվել են գիշերվա ընթացքում 37°C-ում խոնավ խցիկում:Խաչաձև կապակցված պեպտիդը զտվել է 25 րոպե ցենտրիֆուգմամբ:Պեպտիդների վերականգնումը բարելավվել է՝ ֆիլտրին ավելացնելով 50 մկլ 0,5 M NaCl, որին հաջորդել է ցենտրիֆուգումը 25 րոպե:
C18 Micro Spin սյուները (Harvard Apparatus) օգտագործվել են խաչաձև կապակցված տրիպտիկ պեպտիդների աղազերծման համար՝ հետևելով Bouchal et al.70-ի կողմից նկարագրված արձանագրությանը փոքր փոփոխություններով:Համառոտ, C18 պտտվող սյունակները ակտիվացվել են 0,1% մածուցիկ թթվի (FA) երեք լվացումներով ացետոնիտրիլով (AcN) (Merck) և երկու լվացումներով 0,1% FA-ով:Սյունակը 15 րոպե հիդրացվեց 0,1% FA-ով:Նմուշները լցրեք պտտվող սյուների մեջ և լվացեք 3 անգամ 0,1% FA-ով:Աղազրկված պեպտիդները հաջորդաբար զտվել են աստիճանական գրադիենտով՝ օգտագործելով 50%, 80% և 100% AcN 0.1% FA-ում:Նմուշները չորացվել են SpeedVac Plus խտանյութում (Eppendorf) մինչև մնացորդային հեղուկը ամբողջությամբ անհետացավ:Զտված պեպտիդները լուծվել են 100 մկլ 0,08% տրիֆտորաքացախաթթվի մեջ 2,5% AcN-ում և կոնցենտրացիաները չափվել են NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) վրա:Մոտավորապես 1 մկգ խաչաձեւ կապակցված պեպտիդ մեկ նմուշի մեջ ներարկվել է LC-MS/MS համակարգ:
Խաչաձև կապակցված պեպտիդներն առանձնացվել են UltiMate 3000 RSLCnano LC համակարգի (Thermo Scientific) վրա, որը միացված է Orbitrap Exploris 480 զանգվածային սպեկտրոմետրին (Thermo Scientific):Խաչաձև կապակցված պեպտիդները հավաքվել են 300 մկմ ID, 5 մմ երկարությամբ μ-նախասյուն C18 գրավման սյունակի վրա՝ փաթեթավորված C18 PepMap100 սորբենտով և 5 մկմ PepMap սորբենտով (Thermo Scientific):Բեռնեք պոմպի հոսքը, որը սահմանված է 5 մկլ/րոպե 0,08% տրիֆտորքացախաթթու՝ լուծարված 2,5% AcN-ում:Խաչաձև կապակցված պեպտիդներն առանձնացվել են 75 մկմ ներքին տրամագծով և 150 մմ երկարությամբ վերլուծական միաձուլված սիլիցիումի սյունակի վրա, որը լցված է 2 մկմ PepMap սորբենտով (Thermo Scientific):Շարժական A և B փուլերը բաղկացած էին համապատասխանաբար 0,1% FA-ից ջրում և 0,1% FA-ից ացետոնիտրիլում:Գրադիենտը սկսվում է 2,5% B-ից և գծայինորեն աճում է մինչև 40% B 90 րոպեի ընթացքում, այնուհետև մինչև 90% B հաջորդ 2 րոպեի ընթացքում:Շարժական փուլի կազմը պահպանվել է 90% B-ում 10 րոպե, այնուհետև գծայինորեն նվազել է մինչև 2,5% B 2 րոպեի ընթացքում:Սյունակը հավասարակշռվել է 2,5% B-ում հաջորդ ցիկլից 8 րոպե առաջ:Անալիտիկ սյունակից մաքրված խաչակցված պեպտիդները իոնացվել են նանոէլեկտրասփրեյ իոնացման (NSI) աղբյուրում և ներարկվել Exploris 480 զանգվածային սպեկտրոմետրի մեջ (Thermo Scientific):
Orbitrap Exploris 480 զանգվածային սպեկտրոմետրը գործում էր տվյալների դրական հարաբերակցության ռեժիմում:Ամբողջական սկանավորումն իրականացվել է հատվածի ռեժիմում՝ 120,000 լուծաչափով, միջակայքի կարգավորումներով՝ m/z 350 Th-ից մինչև m/z 2000 Th:Նորմալացված AGC թիրախը սահմանվել է 300%՝ առավելագույն մուտքային ժամանակով 50ms:Պեպտիդների համար մոնոիզոտոպային գագաթնակետային հայտնաբերում է հաստատվել:Սահմանափակումների թուլացման պարամետրը սահմանվում է ճշմարիտ, եթե հայտնաբերվում են չափազանց քիչ պրեկուրսորներ:Պրեկուրսորի նվազագույն իոնային ուժը սահմանվել է 5.0e3, իսկ պրեկուրսորի լիցքի վիճակները մինչև +8 ներառվել են փորձերում:
Տվյալների հարաբերակցության ռեժիմում հիմնական սկանավորումների միջև ցիկլի ժամանակը սահմանվել է 2,5 վայրկյան:Դինամիկ զանգվածի բացառումը սահմանվել է 20 վրկ պրեկուրսոր իոնի առաջին մասնատումից հետո:Նախածանցի մեկուսացման պատուհանը դրվել է 2 Th.Նորմալացված բախման էներգիայի տեսակը ֆիքսված բախման էներգիայի ռեժիմով ընտրվել է տվյալների կախված MS/MS սկանավորման ժամանակ:Բախման էներգիան սահմանվել է 30%:Orbitrap բանաձեւը սահմանվել է 15000, իսկ AGC-ի թիրախը՝ 100%:Մաքսային ներարկման առավելագույն ժամանակը սահմանված է 60 միլիվայրկյան:
Նախքան խաչաձև կապակցված նմուշներում սպիտակուց-սպիտակուցային ցանցին հետևելը, մենք մշակեցինք չմշակված ֆայլերը՝ օգտագործելով MaxQuant փաթեթը (տարբերակ 1.6.12.0)26,27՝ նմուշներում հետագծելի պեպտիդները/սպիտակուցները հայտնաբերելու համար:Բացի այդ, նմանատիպ պրոտեոմային անալիզներ են իրականացվել չխաչկապակցված Flo-1 նմուշների վրա, որոնք մշակվել և չմշակվել են IFNα-ով:MS/MS տվյալները որոնվել են UniProt մարդկային տվյալների բազայում (www.uniprot.org) (վերբեռնվել է 2020 թվականի օգոստոսի 12-ին, պարունակում է 75093 գրառում)՝ օգտագործելով ներկառուցված Andromeda27 որոնողական համակարգը:Որոնումն իրականացվել է առանց նշելու ֆերմենտի սպեցիֆիկությունը և դեամիդացման (N, Q) և օքսիդացման (M) տարբեր մոդիֆիկացիաները։Նախածանցային զանգվածի հանդուրժողականությունը սահմանվել է 20 ppm, իսկ արտադրանքի իոնները՝ 0.02 Da:Զանգվածի սկզբնական և առավելագույն շեղումը սահմանվել է 10 ppm:Պեպտիդի առավելագույն զանգվածը սահմանվել է 4600 Da, իսկ հաջորդականության նմանությունը սահմանվել է 7 և 25 ամինաթթուների միջև (aa):Հետագա վիճակագրական վերլուծություն է կատարվել Perseus ծրագրի միջոցով (տարբերակ 1.6.10.45):Սպիտակուցի պարունակությունը հաշվարկվել է սպիտակուցի սպեկտրային ինտենսիվության նորմալացման միջոցով (LFQ ինտենսիվություն; չպիտակավորված քանակականացում)27 և ինտենսիվության արժեքները փոխարկվել են Log2-ի:Սպիտակուցների հիերարխիկ կլաստերավորումը, որը բացահայտվել է ըստ դրանց պեպտիդների ինտենսիվության, ստեղծվել է՝ օգտագործելով pheatmap (v1.0.12) փաթեթը R-ում (v 4.1.2):Ճանապարհի հարստացման վերլուծությունը կատարվել է օգտագործելով Reactome ուղու տվյալների բազան IFNα-ով բուժված սպիտակուցների համար, որոնք ավելի քան չորս անգամ ակտիվացել են չմշակված նմուշների համեմատ:
LC-MS/MS-ով վերահսկվող սպիտակուցային համալիրների լիզին (K) կամ սերին (S) հատուկ քիմիական խաչաձև կապերի նույնականացումն իրականացվել է խաչաձեւ կապակցված պեպտիդների (SIM-XL) սպեկտրոսկոպիկ նույնականացման մեքենայի (SIM-XL) միջոցով29:Նախ, ինտերֆերոնի հետ կապված (IFN) ԴՆԹ-ի վնասման դիմացկունության դիմադրության (IRDS) գեների միջև հնարավոր փոխազդեցությունները հետազոտվեցին Padariya et al.28-ում նկարագրված IRDS սպիտակուցային տվյալների բազայի միջոցով:Ամբողջ մարդկային UniProt-ի բոլոր պայմանների և կրկնությունների ստուգումը հաշվողականորեն ինտենսիվ է, ուստի մարդկային UniProt-ի ամբողջ տվյալների բազան (www.uniprot.org) (ներբեռնվել է 2020 թվականի օգոստոսի 12-ին, պարունակում է 75,093 գրառում)՝ ընդդեմ IFNα-ով բուժվող կրկնությունների:Բարձր վստահության փոխազդեցության զտիչներից մեկը:Ստացված այս բարձր նշանակալի փոխազդեցությունները ընդլայնվեցին և փորձարկվեցին բոլոր կրկնությունների և պայմաններում:
SIM-XL-ում DSS-ն օգտագործվել է խաչմերուկի (XL) համար, իսկ XL քաշի հերթափոխը և փոփոխման քաշի փոփոխությունը սահմանվել են համապատասխանաբար 138.06 և 156.07:Հետևյալ խաչմերուկային ռեակցիայի վայրերը դիտարկվում են՝ KK, KS և KN-TERM՝ առանց ռեպորտաժի իոնների:Ե՛վ պրեկուրսորը, և՛ բեկորային ppm-ը սահմանվել է 20, իսկ Xrea-ի շեմը՝ 0,15:Տրիպսինը համարվում էր ամբողջովին սպեցիֆիկ, և կիրառվեց բարձր էներգիայի C-trap (HCD) մասնատման մեթոդ:XCorr դինամիկ DB կրճատման շեմը և պեպտիդների նվազագույն քանակը դինամիկ DB կրճատման համար սահմանվել են համապատասխանաբար 2,5 և 2:Մյուս պարամետրերն են՝ մոնիզոտոպների հավանականությունը և գագաթնակետային համընկնման կտրվածքը, նվազագույնը 4 AA մնացորդներ մեկ շղթայի համար և առավելագույն լիցքավորումը, և բաց թողնված ճեղքերի 3 առավելագույնը:Ստացված կարված 2D քարտեզները վերլուծվել են (SIM-XL) և xQuest28 գրաֆիկական ներկայացումն օգտագործվել է 2D քարտեզները կառուցելու համար:Սպիտակուցային կառուցվածքների վրա սպիտակուցային խաչաձեւ կապերը տրամադրվում են PyMol-ում (PyMOL Molecular Graphics System, տարբերակ 2.0 Schrödinger, LLC):
Սպիտակուցի մոդելային կառուցվածքները ստեղծվել են Phyre2 սերվերի միջոցով (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11՝ օգտագործելով հոմոոլոգիայի մոդելավորման և «Թաքնված Մարկովի մեթոդի» իրականացման սկզբունքները:Phyre2-ը ստեղծում է մոդելային կառուցվածքներ՝ հիմնված սպիտակուցի հայտնի կառուցվածքների հետ հաջորդականության համապատասխանեցման վրա:H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 և MDN1 սպիտակուցների համար օգտագործվել են կաղապարային կառուցվածքներ 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 և 6i2665:Բացի այդ, դիտարկվել է նաև AlphaFold71 MX1, UBP18 և ROBO1 կառուցվածքը։Սպիտակուցի կառուցվածքը վիզուալացվել է՝ օգտագործելով BIOVIA Discovery Studio Visualizer փաթեթը (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, ԱՄՆ) և Molecular Operating Environment փաթեթը (MOE; Chemical Computing Group Inc., Մոնրեալ, Քվեբեկ, Կանադա):