347 12,7*1,24 մմ Չժանգոտվող պողպատից փաթաթված խողովակ, α-սինուկլեինի և տաուի համաժամանակյա էլեկտրաստատիկ խտացման և համակցման մոլեկուլային մեխանիզմ

Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար:Դուք օգտագործում եք զննարկչի տարբերակ՝ CSS-ի սահմանափակ աջակցությամբ:Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել Համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում):Բացի այդ, շարունակական աջակցություն ապահովելու համար մենք կայքը ցուցադրում ենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Սլայդերներ, որոնք ցույց են տալիս երեք հոդված յուրաքանչյուր սլայդում:Օգտագործեք հետևի և հաջորդ կոճակները՝ սլայդների միջով շարժվելու համար, կամ սլայդ կարգավորիչի կոճակները վերջում՝ յուրաքանչյուր սլայդով շարժվելու համար:

347 Չժանգոտվող պողպատից խողովակի ճշգրտում

347 12.7*1.24 մմ Չժանգոտվող պողպատից փաթաթված խողովակ

Արտաքին տրամագիծը՝ 6.00 մմ OD մինչև 914.4 մմ OD, Չափերը մինչև 24 դյույմ NB առկա են նախկինում, OD չափի պողպատե խողովակներ առկա են նախկինում:

SS 347 Խողովակների հաստության միջակայք՝ 0,3 մմ – 50 մմ, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT՝ SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S և այլն (0,5-12 մմ) Կամ ոչ սովորական չափս՝ ըստ պահանջի:

Տեսակ՝ SS 347 Անխափան խողովակներ |SS 347 ERW խողովակներ |SS 347 Եռակցված խողովակներ |SS 347 Fabricated Pipes |SS 347 CDW խողովակներ, LSAW խողովակներ / կարով եռակցված / վերագծված

Ձև՝ SS 347 կլոր խողովակներ/խողովակներ, SS 347 քառակուսի խողովակներ/ խողովակներ, SS 347 ուղղանկյուն խողովակներ/ խողովակներ, SS 347 փաթաթված խողովակներ, SS 347 «U» ձև, SS 347 թավայի տորթերի պարույրներ, SS 347 հիդրավլիկ խողովակներ

Երկարություն՝ մեկ պատահական, կրկնակի պատահական և պահանջվող երկարություն՝ պարզ ծայր, փեղկավոր ծայր, քայլվածք

Վերջի պաշտպանություն. պլաստիկ գլխարկներ |Արտաքին հարդարում. 2B, No.4, No.1, No.8 հայելային հարդարում չժանգոտվող պողպատից խողովակների համար, ավարտը ըստ հաճախորդի պահանջների

Առաքման պայման՝ հալված և թթու դրված, փայլեցված, վառ հալված, սառը գծված

Ստուգում, փորձարկման հաշվետվություններ. գործարանի փորձարկման վկայագրեր, EN 10204 3.1, քիմիական հաշվետվություններ, մեխանիկական հաշվետվություններ, PMI փորձարկման հաշվետվություններ, տեսողական ստուգման հաշվետվություններ, երրորդ կողմի ստուգման հաշվետվություններ, NABL-ի հաստատված լաբորատոր հաշվետվություններ, կործանարար փորձարկման հաշվետվություն, ոչ կործանարար փորձարկման հաշվետվություններ

Փաթեթավորում. Փաթեթավորված է փայտե տուփերում, պլաստիկ պայուսակներում, պողպատե շերտերով փաթեթավորված կամ ըստ հաճախորդների խնդրանքների

Հատուկ. Չափերը և Տեխնիկական պայմանները, բացի վերը նշվածից, կարող են արտադրվել ըստ ցանկության

SS 347 Խողովակների Չափերի միջակայք՝ 1/2 դյույմ NB, OD-ից 24 դյույմ

ASTM A312 347. Անխափան և ուղիղ կարով եռակցված աուստենիտիկ խողովակ, որը նախատեսված է բարձր ջերմաստիճանի և ընդհանուր քայքայիչ ծառայության համար:Եռակցման ընթացքում լցնող մետաղը չի թույլատրվում:

ASTM A358 347. Էլեկտրական միաձուլված եռակցված ավստենիտիկ խողովակ քայքայիչ և/կամ բարձր ջերմաստիճանի սպասարկման համար:Սովորաբար միայն մինչև 8 դյույմ խողովակ է արտադրվում այս հատկանիշով:Եռակցման ժամանակ թույլատրվում է լցավորող մետաղի ավելացում:

ASTM A790 347. Անխափան և ուղիղ կարով եռակցված ֆերիտիկ/ավստենիտիկ (դյուպլեքս) խողովակ, որը նախատեսված է ընդհանուր քայքայիչ ծառայության համար՝ հատուկ շեշտադրումով սթրեսային կոռոզիայից ճաքերի դիմադրության վրա:

ASTM A409 347. Ուղիղ կարով կամ պարուրաձև կարերով եռակցված մեծ տրամագծով ավստենիտիկ թեթև պատի էլեկտրական խողովակ 14"-ից 30" չափսերով Sch5S և Sch 10S պատերով՝ քայքայիչ և/կամ բարձր

ASTM A376 347: Անխափան ավստենիտիկ խողովակ բարձր ջերմաստիճանի կիրառման համար:

ASTM A813 347. Մեկ կարով, մեկ կամ կրկնակի եռակցված աուստենիտիկ խողովակ բարձր ջերմաստիճանի և ընդհանուր քայքայիչ կիրառությունների համար:

ASTM A814 347. Սառը մշակված եռակցված աուստենիտիկ խողովակ բարձր ջերմաստիճանի և ընդհանուր քայքայիչ ծառայության համար:

347H չժանգոտվող պողպատից խողովակների քիմիական բաղադրություն

Չժանգոտվող պողպատից 347H խողովակի մեխանիկական հատկություններ

Չժանգոտվող պողպատից 347H խողովակների ֆիզիկական հատկություններ

347H չժանգոտվող պողպատից խողովակի համարժեք գնահատականներ

Ամիլոիդ ալֆա-սինուկլեինի (αS) ագրեգացիան Պարկինսոնի հիվանդության և այլ սինուկլեինոպաթիաների բնորոշ նշանն է:Վերջերս տաու սպիտակուցը, որը սովորաբար կապված է Ալցհեյմերի հիվանդության հետ, կապված է αS պաթոլոգիայի հետ և գտնվել է, որ այն համատեղ տեղայնացվում է αS-ով հարուստ ընդգրկումներում, թեև երկու սպիտակուցների միավորման մոլեկուլային մեխանիզմը մնում է անհասկանալի:Այստեղ մենք հայտնում ենք, որ αS փուլը բաժանվում է հեղուկ կոնդենսատների էլեկտրաստատիկ բարդ խտացման միջոցով դրական լիցքավորված պոլիպեպտիդներով, ինչպիսին է tau-ն:Կախված պոլիկատիոնների նկատմամբ αS-ի մերձությունից և կոագուլյացիոն ցանցի վալենտական ​​սպառման արագությունից, թրոմբները ենթարկվում են արագ գելացման կամ միաձուլման, որին հաջորդում է ամիլոիդների դանդաղ ագրեգացումը:Համատեղելով առաջադեմ կենսաֆիզիկական տեխնիկայի փաթեթը՝ մենք կարողացանք բնութագրել հեղուկ-հեղուկ αS/Tau փուլային տարանջատումը և բացահայտել այն հիմնական գործոնները, որոնք հանգեցնում են հեղուկ սպիտակուցի կոնդենսատում երկու սպիտակուցներ պարունակող տարասեռ ագրեգատների ձևավորմանը:
Բացի թաղանթային բաժանմունքներից, բջիջներում տարածական տարանջատումը կարող է իրականացվել նաև սպիտակուցներով հարուստ, հեղուկ նման խիտ մարմինների ձևավորմամբ, որոնք կոչվում են բիոմոլեկուլային կոնդենսատներ կամ կաթիլներ, գործընթացի միջոցով, որը հայտնի է որպես հեղուկ-հեղուկ փուլային տարանջատում (LLPS):Այս կաթիլները ձևավորվում են բազմարժեք ժամանակային փոխազդեցությունների արդյունքում, սովորաբար սպիտակուցների կամ սպիտակուցների և ՌՆԹ-ի միջև և կատարում են տարբեր գործառույթներ գրեթե բոլոր կենդանի համակարգերում:Մեծ թվով LLP-ունակ սպիտակուցներ ցուցադրում են ցածր բարդության հաջորդականություն, որոնք խիստ խանգարված են բնույթով և կենսամոլեկուլային կոնդենսատների ձևավորման մեջ3,4,5:Բազմաթիվ փորձարարական ուսումնասիրություններ ցույց են տվել այս հեղուկանման կոնդենսատները կազմող սպիտակուցների ճկուն, հաճախ անկանոն և բազմավալենտ բնույթը, թեև քիչ բան է հայտնի մոլեկուլային որոշիչ գործոնների մասին, որոնք վերահսկում են այս կոնդենսատների աճը և հասունացումը ավելի պինդ նմանության: պետություն..
Նոր տվյալները հաստատում են այն վարկածը, որ սպիտակուցի վրա հիմնված շեղված LLPS-ը և կաթիլների փոխակերպումը պինդ կառուցվածքների կարող են լինել համապատասխան բջջային ուղիներ, որոնք տանում են դեպի չլուծվող թունավոր ագրեգատների ձևավորում, որոնք հաճախ դեգեներատիվ հիվանդությունների բնորոշ նշաններ են:Բազմաթիվ LLPS-ի հետ կապված ներքին խանգարված սպիտակուցներ (ՄԶՊ), որոնք հաճախ բարձր լիցքավորված և ճկուն են, վաղուց կապված են նեյրոդեգեներացիայի հետ՝ ամիլոիդների ագրեգացման գործընթացի միջոցով:Մասնավորապես, բիոմոլեկուլային IDP կոնդենսատները, ինչպիսիք են FUS7-ը կամ TDP-438-ը, կամ ցածր բարդության մեծ տիրույթներով, ինչպիսին է hnRNPA19-ը, ցույց են տվել, որ ծերանում են գելանման կամ նույնիսկ պինդ ձևերի միջոցով, որը կոչվում է հեղուկացում:միացություն.դեպի պինդ փուլային անցում (LSPT)՝ որպես ժամանակի ֆունկցիա կամ ի պատասխան որոշակի հետթարգմանական փոփոխությունների կամ պաթոլոգիկապես նշանակալի մուտացիաների1,7:
Մեկ այլ ՄԶԾ, որը կապված է LLPS in vivo-ի հետ, Tau-ն է՝ միկրոխողովակներով կապված խանգարված սպիտակուցը, որի ամիլոիդային ագրեգացիան ներգրավված է Ալցհեյմերի հիվանդության մեջ10, սակայն վերջերս նաև ներգրավված է Պարկինսոնի հիվանդության (PD) և այլ սինապտիկ միջուկային պրոտեինոպաթիաների հետ կապված 11, 12, 13:Ցույց է տրվել, որ տաու-ն ինքնաբերաբար տարանջատվում է լուծույթից/ցիտոպլազմայից բարենպաստ էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությունների պատճառով14, ինչի արդյունքում ձևավորվում են տաու հարստացված կաթիլներ, որոնք հայտնի են որպես էլեկտրաստատիկ կոացերվատներ:Նկատվել է նաև, որ այս տեսակի ոչ սպեցիֆիկ փոխազդեցությունը բնության մեջ շատ բիոմոլեկուլային կոնդենսատների շարժիչ ուժն է15:Տաու սպիտակուցի դեպքում էլեկտրաստատիկ ագրեգացիան կարող է ձևավորվել պարզ ագրեգացիայի միջոցով, որի դեպքում սպիտակուցի հակառակ լիցքավորված հատվածները հրահրում են տրոհման գործընթացը, կամ բարդ ագրեգացիայի միջոցով՝ բացասական լիցքավորված պոլիմերների հետ փոխազդեցության միջոցով, ինչպիսին է ՌՆԹ-ն:
Վերջերս α-սինուկլեինը (αS), ամիլոիդ IDP, որը կապված է PD-ի և այլ նեյրոդեգեներատիվ հիվանդությունների հետ, որոնք միասին հայտնի են որպես սինուկլեինոպաթիա17,18, ցուցադրվել է բջջային և կենդանական մոդելներում19,20, որը կենտրոնացած է հեղուկի նման վարքով սպիտակուցային կոնդենսատներում:In vitro ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ αS-ն ենթարկվում է LLPS պարզ ագրեգացման՝ հիմնականում հիդրոֆոբ փոխազդեցությունների միջոցով, թեև այս գործընթացը պահանջում է սպիտակուցի բացառիկ բարձր կոնցենտրացիաներ և ոչ տիպիկ երկար ինկուբացիոն ժամանակներ19,21:Արդյոք αS պարունակող կոնդենսատները, որոնք դիտվում են in vivo-ում, առաջանում են այս կամ այլ LLPS գործընթացների արդյունքում, մնում է առանցքային չլուծված խնդիր:Նմանապես, չնայած αS ամիլոիդային ագրեգացիա նկատվել է PD-ի և այլ սինուկլեինոպաթիաների նեյրոններում, ճշգրիտ մեխանիզմը, որով αS-ն ենթարկվում է ներբջջային ամիլոիդային ագրեգացման, մնում է անհասկանալի, քանի որ այս սպիտակուցի գերարտահայտումը, ըստ երևույթին, ինքնին չի հրահրում այս գործընթացը:Հաճախ պահանջվում է լրացուցիչ բջջային վնաս, ինչը ենթադրում է, որ որոշակի բջջային վայրեր կամ միկրոմիջավայրեր են պահանջվում ներբջջային αS ամիլոիդների հավաքների վերամիջուկացման համար:Բջջային միջավայրերից մեկը, որը հատկապես հակված է ագրեգացման, կարող է լինել սպիտակուցային կոնդենսատների ինտերիերը 23:
Հետաքրքիր է, որ αS-ը և tau-ն համատեղ տեղայնացվում են Պարկինսոնի հիվանդությամբ և այլ սինուկլեինոպաթիաներով մարդկանց բնորոշ հիվանդությունների մեջ 24,25 և փորձերը հայտնել են երկու սպիտակուցների միջև սիներգիստական ​​պաթոլոգիական հարաբերություններ 26,27, ինչը ենթադրում է պոտենցիալ կապ αS-ի և ագրեգացիայի միջև: tau նեյրոդեգեներատիվ հիվանդությունների ժամանակ.հիվանդություն.Պարզվել է, որ αS-ը և tau-ն փոխազդում և խթանում են միմյանց ագրեգացիան in vitro և in vivo 28,29 և այս երկու սպիտակուցներից կազմված տարասեռ ագրեգատներ նկատվել են սինուկլեինոպաթիաներով հիվանդների ուղեղում 30:Այնուամենայնիվ, քիչ բան է հայտնի αS-ի և tau-ի փոխազդեցության մոլեկուլային հիմքի և դրա համախմբման մեխանիզմի մասին։Հաղորդվում է, որ αS-ը փոխազդում է տաուի հետ էլեկտրաստատիկ ձգողության միջոցով αS-ի խիստ բացասական լիցքավորված C-տերմինալ շրջանի և տաու կենտրոնական պրոլինով հարուստ շրջանի միջև, որը նույնպես հարստացված է դրական լիցքավորված մնացորդներով:
Այս ուսումնասիրության մեջ մենք ցույց ենք տալիս, որ αS-ն իսկապես կարող է տարանջատվել կաթիլների՝ էլեկտրաստատիկ բարդ խտացման միջոցով տաու սպիտակուցի առկայության դեպքում՝ ի տարբերություն դրական լիցքավորված այլ պոլիպեպտիդների հետ փոխազդեցության, ինչպիսին է պոլի-L-լիզինը (pLK), և այս գործընթացում:αS-ը գործում է որպես լաստակի մոլեկուլ կաթիլային ցանցի համար:Մենք նկատել ենք նկատելի տարբերություններ էլեկտրաստատիկ αS կոացերվատների հասունացման գործընթացում, որոնք կապված են կոացերվատային ցանցում ներգրավված սպիտակուցների փոխազդեցության արժեքի և ուժի տարբերությունների հետ:Հետաքրքիր է, որ մենք նկատեցինք αS և տաու ամիլոիդ սպիտակուցների համախմբումը երկարակյաց հեղուկ կոացերվատներում և հայտնաբերեցինք որոշ հիմնական գործոններ, որոնք հանգեցնում են այս երկու սպիտակուցների համախմբմանը նման կոացերվատներում:Այստեղ մենք մանրամասն նկարագրում ենք այս գործընթացը, որը հնարավոր մոլեկուլային մեխանիզմ է, որի հիմքում ընկած է երկու սպիտակուցների համակցումը հիվանդության հատուկ ընդգրկումներում:
αS-ն ունի բարձր անիոնային C-տերմինալ պոչ՝ չեզոք pH-ում (նկ. 1ա), և մենք ենթադրեցինք, որ այն կարող է ենթարկվել LLPS՝ պոլիկատիոնային խանգարված պոլիպեպտիդային մոլեկուլներով էլեկտրաստատիկ համալիրների խտացման միջոցով:Մենք օգտագործեցինք 100 մնացորդային պոլի-L-լիզին (pLK) որպես մեկնարկային մոդելի մոլեկուլ՝ դրա դրական լիցքավորված և խանգարված պոլիմերային բնույթի պատճառով չեզոք pH 32-ում: Նախ, մենք հաստատեցինք, որ pLK-ն փոխազդում է αS-ի Ct տիրույթի հետ Solution NMR սպեկտրոսկոպիայի միջոցով: (Նկար 1b) օգտագործելով 13C/15N պիտակավորված αS՝ աճող αS:pLK մոլային հարաբերությունների առկայության դեպքում:pLK-ի փոխազդեցությունը αS-ի Ct-տիրույթի հետ դրսևորվում է քիմիական տեղաշարժի խանգարումներով և սպիտակուցի այս շրջանում գագաթնակետային ինտենսիվության նվազմամբ:Հետաքրքիր է, որ երբ մենք խառնեցինք αS-ը pLK-ի հետ αS կոնցենտրացիայով մոտ.5–25 մկՄ պոլիէթիլեն գլիկոլի (5–15% PEG-8) առկայության դեպքում (տիպիկ LLPS բուֆեր՝ 10 մՄ HEPES pH 7.4, 100 մՄ NaCl, 15% PEG-8) մենք անմիջապես անցանք սպիտակուցի ձևավորման լայն դաշտ։ .Կաթիլները դիտվել են ֆլուորեսցենտային (WF) և պայծառ դաշտի (BF) մանրադիտակի միջոցով (նկ. 1c):1-5 մկմ կաթիլներ, որոնք պարունակում են խտացված αS (ավելացվել է 1 μM AlexaFluor488 պիտակավորված αS, AF488-αS), դրանց էլեկտրաստատիկ հատկությունները կարող են ստացվել 10% 1,6-հեքսանդիոլի (1,6-HD) նկատմամբ նրանց դիմադրողականությունից և դրա զգայունությունից: NaCl-ի կոնցենտրացիայի ավելացում (նկ. 1c):αS/pLK էլեկտրաստատիկ համալիրի կոացերվատների հեղուկանման բնույթը ցուցադրվում է միլիվայրկյանների ընթացքում միաձուլվելու նրանց ունակությամբ (նկ. 1d):Օգտագործելով պղտորաչափությունը՝ մենք քանակականացրեցինք կաթիլների ձևավորումը այս պայմաններում, հաստատեցինք հիմնական փոխազդեցության էլեկտրաստատիկ բնույթը՝ կապված դրա կայունության հետ (նկ. 1e) և գնահատեցինք տարբեր պոլիմերային հարաբերակցությունների ազդեցությունը LLPS գործընթացի վրա (նկ. 1f):Չնայած կաթիլների ձևավորումը նկատվում է պոլիմերային հարաբերակցության լայն շրջանակում, գործընթացը շատ բարենպաստ է, երբ pLK-ն գերազանցում է αS-ը:LLP-ները նաև նկատվել են՝ օգտագործելով քիմիապես տարբեր տեղահանող նյութը՝ դեքստրան-70 (70 կԴա) կամ օգտագործելով տարբեր նմուշների ձևաչափեր, այդ թվում՝ ապակե սլայդների կաթիլներ, տարբեր նյութերի միկրոափսե հորեր, Էպենդորֆ կամ քվարցային մազանոթներ:
Այս ուսումնասիրության մեջ օգտագործված WT-αS և ΔCt-αS տարբերակներում տարբեր սպիտակուցային շրջանների սխեմատիկ ներկայացում:Ամֆիպաթիկ N-տերմինալ տիրույթը, հիդրոֆոբ ամիլոիդ առաջացնող (NAC) շրջանը և բացասական լիցքավորված C-տերմինալ տիրույթը համապատասխանաբար ցուցադրվում են կապույտ, նարնջագույն և կարմիր գույներով:Ցուցադրված է WT-αS-ի զուտ վճարը մեկ մնացորդային (NCPR) քարտեզը:b NMR վերլուծություն αS/pLK փոխազդեցության մակրոմոլեկուլային կուտակումների բացակայության դեպքում:Քանի որ pLK-ի կոնցենտրացիան մեծանում է (αS:pLK 1:0.5, 1:1.5 և 1:10 մոլային հարաբերակցությունները համապատասխանաբար ցուցադրվում են բաց կանաչ, կանաչ և մուգ կանաչ գույներով):գ Coacervate αS/pLK (մոլային հարաբերակցություն 1:10) 25 μM (1 μM AF488 պիտակավորված αS կամ Atto647N պիտակավորված pLK WF պատկերման համար) LLPS բուֆերում (վերևում) կամ լրացվում է 500 մՄ NaCl (ներքևում ձախ) կամ 10-ից հետո: % 1,6-հեքսանդիոլ (1,6-HD; ներքևի աջ):Սանդղակի սանդղակը = 20 մկմ:դ αS/pLK-ի BF-ի կաթիլային միաձուլման ներկայացուցչական մանրադիտակային պատկերներ (մոլային հարաբերակցությունը 1:10) 25 մկմ կոնցենտրացիայում;սլաքները ցույց են տալիս առանձին կաթիլների (կարմիր և դեղին սլաքներ) միաձուլումը նոր կաթիլի մեջ (նարնջագույն սլաք) 200 ms-ի ընթացքում):Սանդղակի սանդղակը = 20 մկմ:ե Լույսի ցրում (350 նմ) ​​αS/pLK ագրեգացիա LLPS բուֆերում՝ 500 մՄ NaCl կամ 10% 1,6-HD 25 μM αS-ի ավելացումից առաջ և հետո (N = 3 նմուշի կրկնություն, միջին և ստանդարտ շեղումը նույնպես նշված է):f BF պատկեր (վերևում) և լույսի ցրման վերլուծություն (350 նմ, ներքևում) αS/pLK ագրեգացիայի 25 μM αS-ում αS:pLK մոլային հարաբերակցության աճով (N = 3 նմուշի կրկնություն, միջին և ստանդարտ շեղումը նույնպես նշված է):Սանդղակի սանդղակը = 10 մկմ:Մեկ պատկերի սանդղակի սանդղակը ցույց է տալիս մեկ վահանակի բոլոր պատկերների սանդղակը:Հում տվյալները տրամադրվում են չմշակված տվյալների ֆայլերի տեսքով:
Հիմնվելով αS/pLK էլեկտրաստատիկ համալիրի խտացման մեր դիտարկումների և αS-ի նախկին դիտարկումների վրա՝ որպես tau/RNA խտացման հաճախորդ մոլեկուլ՝ tau31-ի հետ անմիջական փոխազդեցության միջոցով, մենք ենթադրեցինք, որ αS-ը և tau-ն կարող են համատեղվել լուծիչի հետ ՌՆԹ-ի բացակայության դեպքում: խտացում.էլեկտրաստատիկ կոմպլեքսների միջոցով, և αS-ն լաստակի սպիտակուցն է αS/Tau coacervates-ում (տես տաու լիցքի բաշխումը Նկար 2e-ում):Մենք նկատեցինք, որ երբ 10 μM αS և 10 μM Tau441 (պարունակում է 1 μM AF488-αS և 1 μM Atto647N-Tau, համապատասխանաբար) խառնվել են LLPS բուֆերում, նրանք հեշտությամբ ձևավորել են երկու սպիտակուցներ պարունակող սպիտակուցային ագրեգատներ, ինչպես երևում է WF միկրոսկոպիայի միջոցով:(նկ. 2ա):Կաթիլների մեջ երկու սպիտակուցների կոլոկալիզացիան հաստատվել է կոնֆոկալ (CF) մանրադիտակով (Լրացուցիչ նկար 1ա):Նմանատիպ վարքագիծ է նկատվել, երբ դեքստրան-70-ն օգտագործվում էր որպես ագրեգացիոն նյութ (Լրացուցիչ նկ. 1c):Օգտագործելով կամ FITC պիտակավորված PEG կամ դեքստրան, մենք գտանք, որ երկու ամբոխային նյութերը հավասարապես բաշխված են նմուշների վրա՝ ցույց տալով ոչ տարանջատում, ոչ էլ ասոցիացիա (Լրացուցիչ նկար 1d):Ավելի շուտ, դա ենթադրում է, որ այս համակարգում նրանք նպաստում են փուլերի տարանջատմանը մակրոմոլեկուլային կուտակման էֆեկտների միջոցով, քանի որ PEG-ը գերադասելի կայուն ամբոխավարող նյութ է, ինչպես երևում է LLP այլ համակարգերում33,34:Այս սպիտակուցներով հարուստ կաթիլները զգայուն էին NaCl-ի (1 M), բայց ոչ 1,6-HD-ի (10% v/v) նկատմամբ՝ հաստատելով դրանց էլեկտրաստատիկ հատկությունները (Լրացուցիչ նկար 2a, b):Նրանց հեղուկի վարքագիծը հաստատվել է միլիվայրկյանով միաձուլվող կաթիլային իրադարձությունների դիտարկմամբ՝ օգտագործելով BF մանրադիտակը (նկ. 2b):
աS/Tau441-ի կոնֆոկալ (CF) մանրադիտակի պատկերները միաձուլվում են LLPS բուֆերում (յուրաքանչյուր սպիտակուցի 10 մկմ, AF488-ով պիտակավորված αS-ի 0,5 մկմ և Atto647N-ով պիտակավորված Tau441):b αS/Tau441 կաթիլային միաձուլման իրադարձությունների ներկայացուցչական դիֆերենցիալ միջամտության հակադրություն (DIC) պատկերներ (10 μM յուրաքանչյուր սպիտակուցի համար):գ Փուլային դիագրամ՝ հիմնված Tau441 LLPS-ի (0–15 մկՄ) լույսի ցրման վրա (350 նմ) ​​50 μM αS-ի բացակայության (ձախ) կամ առկայության (աջ) վրա:Ավելի տաք գույները ցույց են տալիս ավելի շատ ցրվածություն:դ αS/Tau441 LLPS նմուշների լույսի ցրում αS կոնցենտրացիայի աճով (Tau441 5 μM-ում, N = 2–3 նմուշի կրկնություններ, ինչպես նշված է):e Այս ուսումնասիրության մեջ օգտագործված տաու սպիտակուցի որոշ տարբերակների և սպիտակուցի տարբեր շրջանների սխեմատիկ ներկայացում. բացասական լիցքավորված N-տերմինալ տիրույթ (կարմիր), պրոլինով հարուստ շրջան (կապույտ), միկրոխողովակներով կապող տիրույթ (MTBD, ընդգծված նարնջագույնով) և ամիլոիդ առաջացնող զույգ պարույր:թելիկային շրջաններ (PHF), որոնք գտնվում են MTBD-ում (մոխրագույն):Ցուցադրված է Tau441-ի զուտ վճարը մեկ մնացորդի (NCPR) քարտեզը:f Օգտագործելով 1 μM AF488 պիտակավորված αS և Atto647N պիտակավորված ΔNt-, օգտագործելով 1 μM AF488 պիտակավորված αS կամ ΔCt-αS՝ ΔNt-Tau (վերևում, 10 μM մեկ սպիտակուցի համար) կամ K18 (ներքևում, 50 μM մեկ սպիտակուցի համար): ) ) ) WF-ի միկրոգրաֆիաները խտացված LLPS կամ K18 բուֆերում:Մեկ պատկերի սանդղակի գծերը ներկայացնում են մեկ վահանակի բոլոր պատկերների սանդղակը (20 մկմ a, b և f վահանակների համար):c և d վահանակների չմշակված տվյալները տրամադրվում են որպես չմշակված տվյալների ֆայլեր:
LLPS-ի այս գործընթացում αS-ի դերը ստուգելու համար մենք նախ ուսումնասիրեցինք αS-ի ազդեցությունը կաթիլների կայունության վրա նեֆելոմետրիայի միջոցով՝ օգտագործելով NaCl-ի աճող կոնցենտրացիաները (նկ. 2c):Որքան բարձր է աղի կոնցենտրացիան αS պարունակող նմուշներում, այնքան բարձր են լույսի ցրման արժեքները (350 նմ), ինչը ցույց է տալիս αS-ի կայունացնող դերը այս LLPS համակարգում:Նմանատիպ էֆեկտ կարելի է նկատել αS-ի կոնցենտրացիան (և հետևաբար αS:Tau441 հարաբերակցությունը) ավելացնելով մինչև մոտ.10 անգամ աճ տաուի կոնցենտրացիայի համեմատ (5 մկՄ) (նկ. 2դ):Ցույց տալու համար, որ αS-ը լաստակի սպիտակուց է կոասերվատներում, մենք որոշեցինք ուսումնասիրել LLPS-ով խափանված Tau մուտանտի վարքագիծը, որը չունի բացասական լիցքավորված N-տերմինալ շրջան (մնացորդներ 1–150, տես նկ. 2e), որը կոչվում է ΔNt-Tau:WF մանրադիտակը և նեֆելոմետրիան հաստատեցին, որ ΔNt-Tau-ն ինքնին չի ենթարկվել LLPS (Նկար 2f և Լրացուցիչ Նկ. 2d), ինչպես նախկինում հաղորդվել է 14: Այնուամենայնիվ, երբ αS-ն ավելացվեց այս կտրված Tau տարբերակի ցրված լուծույթներին, LLPS գործընթացն ամբողջությամբ ավարտվեց: վերականգնվել է կաթիլային խտությամբ, որը մոտ է Tau-ի և αS-ի լրիվ չափի լուծույթների կաթիլային խտությանը նմանատիպ պայմաններում և սպիտակուցի կոնցենտրացիաներում:Այս գործընթացը կարող է դիտվել նաև ցածր մակրոմոլեկուլային կուտակումների պայմաններում (Լրացուցիչ նկար 2c):C-տերմինալ αS շրջանի դերը, բայց ոչ ամբողջ երկարությունը, LLPS գործընթացում ցուցադրվել է կաթիլների ձևավորման արգելակմամբ՝ օգտագործելով C-տերմինալ կտրված αS տարբերակ, որը զուրկ է (ΔCt-) 104-140 մնացորդներից (նկ. 1ա): αS) սպիտակուց (նկ. 2f և լրացուցիչ նկար 2դ):αS-ի և ΔNt-Tau-ի կոլոկալիզացիան հաստատվել է կոնֆոկալ ֆլուորեսցենտային մանրադիտակով (Լրացուցիչ նկար 1b):
Tau441-ի և αS-ի միջև LLPS մեխանիզմը հետագա փորձարկելու համար օգտագործվել է Tau-ի լրացուցիչ տարբերակ, այն է՝ զուգակցված պտուտակային թելիկի միջուկը (PHF) միկրոխողովակային կապող տիրույթում (MTBD), որը, եթե այն պարունակում է չորս բնորոշ կրկնվող տիրույթներ, որոնք սովորաբար հայտնի են նաև։ որպես K18 հատված (տես նկ. 2e):Վերջերս հաղորդվել է, որ αS-ը նախընտրելիորեն կապվում է տաու սպիտակուցին, որը գտնվում է պրոլինով հարուստ տիրույթում մի հաջորդականությամբ, որը նախորդում է միկրոխողովակներով կապող տիրույթին:Այնուամենայնիվ, PHF տարածաշրջանը հարուստ է նաև դրական լիցքավորված մնացորդներով (տես Նկար 2e), հատկապես լիզինով (15% մնացորդներ), ինչը մեզ հուշեց փորձելու, թե արդյոք այս շրջանը նույնպես նպաստում է αS/Tau համալիրի խտացմանը:Մենք նկատեցինք, որ միայն K18-ը չէր կարող ակտիվացնել LLPS-ը մինչև 100 μM կոնցենտրացիաների դեպքում՝ փորձարկված պայմաններում (LLPS բուֆեր՝ 15% PEG կամ 20% դեքստրանով) (Նկար 2f):Այնուամենայնիվ, երբ մենք ավելացրինք 50 μM αS 50 μM K18-ին, K18 և αS պարունակող սպիտակուցի կաթիլների արագ ձևավորումը նկատվեց նեֆելոմետրիայի (Լրացուցիչ նկար 2d) և WF մանրադիտակի միջոցով (նկ. 2f):Ինչպես և սպասվում էր, ΔCt-αS-ն չկարողացավ վերականգնել K18-ի LLPS վարքը (նկ. 2f):Մենք նշում ենք, որ αS/K18 ագրեգացիան պահանջում է մի փոքր ավելի բարձր սպիտակուցային կոնցենտրացիաներ՝ LLPS-ի առաջացման համար՝ համեմատած αS/ΔNt-Tau-ի կամ αS/Tau441-ի հետ, մյուսները հավասար են:Սա համահունչ է αS C-տերմինալ շրջանի ավելի ուժեղ փոխազդեցությանը պրոլինով հարուստ Tau տիրույթի հետ համեմատած միկրոխողովակներով կապող տիրույթի հետ, ինչպես նկարագրված է նախկինում 31:
Հաշվի առնելով, որ ΔNt-Tau-ն չի կարող իրականացնել LLPS αS-ի բացակայության դեպքում, մենք ընտրեցինք այս Tau տարբերակը՝ որպես αS/Tau LLPS-ը բնութագրելու մոդել՝ հաշվի առնելով դրա պարզությունը LLPS համակարգերում լիամետրաժ Tau-ով (իզոտիպ, Tau441/Tau441):բարդ (հետերոտիպ, αS/Tau441) ագրեգացման պրոցեսներով։Մենք համեմատեցինք αS ագրեգացիայի աստիճանը (որպես խտացված ֆազային սպիտակուցի մաս, fαS,c) αS/Tau և αS/ΔNt-Tau համակարգերում ցենտրիֆուգման և ցրված փուլի SDS-PAGE վերլուծության միջոցով (տես 2e), գտանք շատ նման արժեքներ: բոլոր սպիտակուցների համար՝ նույն կոնցենտրացիայով:Մասնավորապես, մենք ստացանք fαS,c 84 ± 2% և 79 ± 7% αS/Tau և αS/ΔNt-Tau-ի համար համապատասխանաբար՝ ենթադրելով, որ αS-ի և tau-ի հետերոտիպային փոխազդեցությունը գերազանցում է tau մոլեկուլների փոխազդեցությանը:միջեւ։
Տարբեր պոլիկատիոնների հետ փոխազդեցությունը և խտացման գործընթացի ազդեցությունը αS կինետիկայի վրա առաջին անգամ ուսումնասիրվել են ֆոտոսպիտակեցումից հետո (FRAP) ֆլուորեսցենցիայի վերականգնման մեթոդով:Մենք փորձարկեցինք αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau և αS/pLK coacervates (100 μM αS լրացված 2 μM αS AF488-αS և 100 μM Tau441 կամ ΔNt-Tau կամ 1 mM pLK):Տվյալները ստացվել են նմուշի բաղադրիչները խառնելուց հետո առաջին 30 րոպեների ընթացքում:FRAP-ի ներկայացուցչական պատկերներից (նկ. 3a, αS/Tau441 խտացում) և դրանց համապատասխան ժամանակի ընթացքի կորերից (նկ. 3b, Լրացուցիչ Նկ. 3), կարելի է տեսնել, որ αS կինետիկան շատ նման է Tau441 կոացերվատների կինետիկներին:և ΔNt-Tau, որը շատ ավելի արագ է pLK-ով:Հաշվարկված դիֆուզիոն գործակիցները αS-ի համար կոացերվատի ներսում՝ ըստ FRAP-ի (ինչպես նկարագրված է Kang et al. 35-ի կողմից) D = 0,013 ± 0,009 μm2/վրկ և D = 0,026 ± 0,008 μm2/վ αS/Tau441-ի համար և αS-ի համար: αS/ համակարգը.pLK, Tau և D = 0,18 ± 0,04 մկմ2/վ, համապատասխանաբար (նկ. 3c):Այնուամենայնիվ, դիֆուզիոն αS գործակիցը ցրված փուլում մի քանի կարգով բարձր է բոլոր խտացված փուլերից, ինչպես որոշվում է ֆլյուորեսցենտային հարաբերակցության սպեկտրոսկոպիայի միջոցով (FCS, տես Լրացուցիչ Նկար 3) նույն պայմաններում (LLPS բուֆեր), բայց պոլիկատիոնների բացակայության դեպքում: (D = 8 ± 4 մկմ2/վ):Հետևաբար, αS-ի թարգմանության կինետիկան զգալիորեն կրճատվում է կոացերվատներում՝ համեմատած ցրված փուլում գտնվող սպիտակուցների հետ՝ մոլեկուլային ցրվածության արտահայտված ազդեցության պատճառով, չնայած բոլոր կոացերվատները պահպանում են հեղուկանման հատկություններ իրենց ձևավորումից հետո առաջին կես ժամում՝ ի տարբերություն տաու փուլի:ավելի արագ կինետիկա pLK կոնդենսատում:
a–c FRAP վերլուծություն αS դինամիկայի (2% AF488 պիտակավորված αS) էլեկտրաստատիկ կոացերվատներում:αS/Tau441 FRAP վերլուծությունների ներկայացուցչական պատկերները եռակի ներկայացված են (ա) կետում, որտեղ կարմիր շրջանակները ցույց են տալիս գունազրկված տարածքները:Սանդղակի սանդղակը 5 մկմ է:b Միջին FRAP կորեր և (գ) հաշվարկված դիֆուզիոն գործակիցներ (D) 5-6 (N) տարբեր կաթիլների համար երեք փորձերից՝ օգտագործելով 100 μM αS և Tau441 (կարմիր) կամ ΔNt-Tau (կապույտ) կամ pLK (կանաչ) համարժեք կոնցենտրացիաներ։ LLPS-ի կոնցենտրացիայի տասնապատիկ չափով:FRAP կորի ստանդարտ շեղումը ցուցադրվում է ստվերային գույնով:Համեմատության համար, դիֆուզիոն αS գործակիցը ցրված փուլում որոշվել է եռակի՝ օգտագործելով ֆլյուորեսցենտային հարաբերակցության սպեկտրոսկոպիա (FCS) (տե՛ս Լրացուցիչ Նկար 3 և մեթոդները լրացուցիչ տեղեկությունների համար):d 100 μM TEMPOL-122-αS-ի շարունակական X-շերտային EPR սպեկտրներ LLPS բուֆերում առանց որևէ պոլիկացիայի (սև) կամ 100 μM Tau441 (կարմիր) կամ ΔNt-Tau (կապույտ) կամ 1 mM pLK (կանաչ) առկայության դեպքում:Ներդիրը ցույց է տալիս ուժեղ դաշտի գծերի խոշորացված տեսարան, որտեղ տեղի են ունենում առավել կտրուկ փոփոխությունները:e 50 μM TEMPOL-122-αS-ի կապող կորեր՝ տարբեր պոլիկատիոններով LLPS-ի բացակայության դեպքում (առանց PEG):Ցույց է տրվում, որ III գոտու կրճատված ամպլիտուդը նորմալացված EPR սպեկտրի II (IIII/III) գոտու համեմատ մեծացնում է Tau441 (կարմիր), ΔNt-Tau (կապույտ) և pLK (կանաչ) մոլային հարաբերակցությունները:Գունավոր գծերը ցույց են տալիս տվյալների համապատասխանությունը՝ օգտագործելով կոպիտ կապող մոդել՝ n նույնական և անկախ կապող տեղամասերով յուրաքանչյուր կորի վրա:Հում տվյալները տրամադրվում են չմշակված տվյալների ֆայլերի տեսքով:
Որպես լրացում, մենք ուսումնասիրեցինք αS-ի դինամիկան տարբեր կոացերվատներում՝ օգտագործելով ուղղորդված սպին պիտակավորում (SDSL) և շարունակական էլեկտրոնային պարամագնիսական ռեզոնանս (CW-EPR):Այս մեթոդն ապացուցել է, որ շատ օգտակար է ՄԶԾ-ի ճկունության և դինամիկայի մասին իրատեսական մնացորդային լուծաչափով զեկուցելու համար36,37,38:Այդ նպատակով մենք կառուցեցինք ցիստեինի մնացորդներ միայնակ Cys մուտանտներում և օգտագործեցինք 4-հիդրօքսի-2,2,6,6-տետրամեթիլպիպերիդին-N-օքսիլ (TEMPOL) սպին զոնդը:Մալեիմիդի ածանցյալները դրանք նշում են:Ավելի կոնկրետ, մենք տեղադրեցինք TEMPOL զոնդերը 122 կամ 24 αS դիրքերում (TEMPOL-122-αS և TEMPOL-24-αS):Առաջին դեպքում մենք թիրախավորում ենք սպիտակուցի C-տերմինալ շրջանը, որը ներգրավված է պոլիկատիոնների հետ փոխազդեցության մեջ:Փոխարենը, 24-րդ դիրքը կարող է մեզ տեղեկատվություն տալ կոնդենսատում առկա սպիտակուցների ընդհանուր դինամիկայի մասին:Երկու դեպքում էլ ցրված փուլի սպիտակուցների համար ստացված EPR ազդանշանները համապատասխանում էին արագ շարժվող վիճակում գտնվող նիտրօքսիդի ռադիկալներին:Tau-ի կամ pLK-ի (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 կամ ΔNt-Tau 1:1 հարաբերակցությամբ կամ pLK 1:10 հարաբերակցությամբ) ներկայությամբ փուլային տարանջատումից հետո, նկատվել է հարաբերական գագաթնակետային ինտենսիվության աճ: αS-ի EPR սպեկտրը:Կորուստների գիծը ընդլայնվեց՝ ցույց տալով կաթիլներում αS-ի վերակողմնորոշման կինետիկան՝ համեմատած նոսր փուլում գտնվող սպիտակուցի հետ (նկ. 3d, լրացուցիչ Նկար 4ա):Այս փոփոխություններն ավելի ցայտուն են 122-րդ դիրքում: Թեև 24-րդ դիրքում pLK-ի առկայությունը չի ազդել զոնդի կինետիկայի վրա, 122-րդ դիրքում սպեկտրային գծի ձևը զգալիորեն փոխվել է (Լրացուցիչ նկար 4ա):Երբ մենք փորձեցինք մոդելավորել սպեկտրը երկու αS/պոլիկացիոն համակարգերի 122 դիրքում, օգտագործելով իզոտրոպ մոդելը (Լրացուցիչ նկար 5ա), որը սովորաբար օգտագործվում է սպինով պիտակավորված IDP38,39-ի դինամիկան նկարագրելու համար, մենք չկարողացանք վերակառուցել փորձարարական սպեկտրները:.24 պտույտի կոնտրաստների դիրքի սպեկտրային մոդելավորում (Լրացուցիչ նկ. 5ա):Սա հուշում է, որ αS-ի C-տերմինալ շրջանի սպինային կոնֆիգուրացիաների տարածության մեջ կան արտոնյալ դիրքեր՝ պոլիկատիոնների առկայության դեպքում:Փորձարարական EPR պայմաններում αS-ի մասնաբաժինը խտացված փուլում դիտարկելիս (84 ± 2%, 79 ± 7%, և 47 ± 4% αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau և αS/pLK-ի համար, համապատասխանաբար, տես Լրացուցիչ. Նկար 2e տվյալների վերլուծության գ), երևում է, որ EPR մեթոդով հայտնաբերված ընդլայնումը հիմնականում արտացոլում է αS-ի C-տերմինալ շրջանի փոխազդեցությունը խտացված փուլում տարբեր պոլիկատիոնների հետ (հիմնական փոփոխությունը TEMPOL-122- օգտագործելիս: αS), և ոչ սպիտակուցի խտացում:Զոնդում նկատվում է միկրովիսկոզիայի բարձրացում:Ինչպես և սպասվում էր, LLPS-ից բացի այլ պայմաններում սպիտակուցի EPR սպեկտրը ամբողջությամբ վերականգնվեց, երբ խառնուրդին ավելացվեց 1 M NaCl (Լրացուցիչ նկար 4b):Ընդհանուր առմամբ, մեր տվյալները ցույց են տալիս, որ CW-EPR-ի կողմից հայտնաբերված փոփոխությունները հիմնականում արտացոլում են αS-ի C-տերմինալ շրջանի փոխազդեցությունը տարբեր պոլիկացիաների հետ խտացված փուլում, և այս փոխազդեցությունը կարծես թե ավելի ուժեղ է pLK-ի, քան Tau-ի հետ:
Կոացերվատի սպիտակուցների մասին ավելի շատ կառուցվածքային տեղեկատվություն ստանալու համար մենք որոշեցինք ուսումնասիրել LLPS համակարգը՝ օգտագործելով NMR լուծույթում:Այնուամենայնիվ, մենք կարողացանք հայտնաբերել միայն αS ֆրակցիան, որը մնում է ցրված փուլում, ինչը կարող է պայմանավորված լինել կոացերվատի ներսում սպիտակուցի նվազման դինամիկայի և NMR վերլուծության լուծույթի ներքևի մասում խիտ ֆազով:Երբ մենք վերլուծեցինք LLPS նմուշի ցրված փուլում մնացած սպիտակուցի կառուցվածքը և դինամիկան NMR-ի միջոցով (Լրացուցիչ նկար 5c, d), մենք նկատեցինք, որ սպիտակուցը գրեթե նույն կերպ վարվեց pLK-ի և ΔNt-Tau-ի առկայության դեպքում, երկուսն էլ՝ որոնք գտնվում էին սպիտակուցի ողնաշարի երկրորդական կառուցվածքի և դինամիկայում, որոնք բացահայտվել են երկրորդային քիմիական տեղաշարժի և R1ρ թուլացման փորձերով:NMR-ի տվյալները ցույց են տալիս, որ αS-ի C-վերջնամասը կրում է կոնֆորմացիոն ճկունության զգալի կորուստ՝ պահպանելով իր խանգարված բնույթը, ինչպես մնացած սպիտակուցային հաջորդականությունը, պոլիկատիոնների հետ իր փոխազդեցության պատճառով:
Քանի որ CW-EPR ազդանշանի ընդլայնումը, որը դիտվել է TEMPOL-122-αS խտացված փուլում, արտացոլում է սպիտակուցի փոխազդեցությունը պոլիկատիոնների հետ, մենք կատարեցինք EPR տիտրացիա՝ գնահատելու αS-ի կապակցման կապը տարբեր պոլիկատիոնների հետ LLPS-ի բացակայության դեպքում (առանց կուտակման: Բուֆերային LLPS), ենթադրելով, որ փոխազդեցությունները նույնն են նոսր և խտացված փուլերում (ինչը հաստատվում է մեր տվյալներով՝ Լրացուցիչ Նկ. 4ա և Լրացուցիչ Նկ. 6):Նպատակն էր տեսնել, թե արդյոք բոլոր կոացերվատները, չնայած իրենց ընդհանուր հեղուկի նման հատկություններին, դրսևորում են որևէ հիմքում ընկած դիֆերենցիալ վարքագիծ մոլեկուլային մակարդակում:Ինչպես և սպասվում էր, EPR սպեկտրը ընդլայնվեց պոլիկատիոնների կոնցենտրացիայի ավելացմամբ՝ արտացոլելով մոլեկուլային ճկունության նվազումը բոլոր փոխազդեցության գործընկերների մոլեկուլային փոխազդեցությունների պատճառով գրեթե մինչև հագեցվածություն (Նկար 3e, Լրացուցիչ Նկ. 6):pLK-ն այս հագեցվածությանը հասել է ավելի ցածր մոլային հարաբերակցությամբ (պոլիկացիա՝ αS) ΔNt-Tau-ի և Tau441-ի համեմատ:Փաստորեն, տվյալների համեմատությունը մոտավոր կապող մոդելի հետ, որը ենթադրում է n նույնական և անկախ կապող տեղամաս, ցույց է տվել, որ pLK-ի ակնհայտ տարանջատման հաստատունը (~ 5 μM) մեծության կարգով ցածր է, քան Tau441-ը կամ ΔNt-Tau-ն (~50 μM): )μM):Չնայած սա մոտավոր գնահատական ​​է, սա ենթադրում է, որ αS-ն ավելի մեծ կապ ունի շարունակական դրական լիցքի շրջաններով պարզ պոլիկատիոնների համար:Հաշվի առնելով αS-ի և տարբեր պոլիկատիոնների միջև կապի այս տարբերությունը, մենք ենթադրեցինք, որ դրանց հեղուկ հատկությունները կարող են տարբեր կերպ փոխվել ժամանակի ընթացքում և, հետևաբար, տուժել տարբեր LSPT գործընթացներից:
Հաշվի առնելով սպիտակուցի կոացերվատի մեջ խիստ մարդաշատ միջավայրը և սպիտակուցի ամիլոիդ բնույթը, մենք ժամանակի ընթացքում դիտարկել ենք կոացերվատի վարքագիծը՝ LSPT հնարավոր գործընթացները հայտնաբերելու համար:Օգտագործելով BF և CF մանրադիտակը (Նկար 4), մենք նկատեցինք, որ αS/Tau441-ը լուծույթում մեծ չափով միաձուլվում է, ձևավորելով մեծ կաթիլներ, որոնք շփվում և խոնավացնում են ջրհորի հատակի մակերեսը/սահում են որպես ամբողջական կաթիլներ, ինչպես և սպասվում էր (Լրացուցիչ Նկ. 7d);մենք այս ներքևի ձևավորված կառույցներն անվանում ենք «սպիտակուցային լաստանավներ»:Այս կառույցները մնացին հեղուկ, քանի որ պահպանում էին միաձուլվելու ունակությունը (Լրացուցիչ Նկ. 7բ) և կարելի էր տեսնել LLPS-ի գործարկումից հետո մի քանի ժամվա ընթացքում (Նկար 4 և Լրացուցիչ նկ. 7գ):Մենք նկատեցինք, որ խոնավացման գործընթացը բարենպաստ է ոչ թե հիդրոֆոբ, այլ հիդրոֆիլ նյութերի մակերեսի վրա (Լրացուցիչ Նկար 7ա), ինչպես ակնկալվում է անհավասարակշիռ լիցքերով և, հետևաբար, էլեկտրաստատիկ մակերևույթի բարձր պոտենցիալներով էլեկտրաստատիկ կոացերվատների համար:Հատկանշական է, որ αS/ΔNt-Tau միաձուլումը և ռաֆթինգը զգալիորեն կրճատվել են, մինչդեռ αS/pLK կոնդենսատները զգալիորեն կրճատվել են (նկ. 4):Կարճ ինկուբացիոն ժամանակահատվածում αS/pLK կաթիլները կարողացան միաձուլվել և թրջել հիդրոֆիլ մակերեսը, բայց այս գործընթացը արագ դադարեց, և 5 ժամ ինկուբացիայից հետո միայն սահմանափակ միաձուլման դեպքեր և թրջում չնկատվեցին:- գել-կաթիլային անցում:
Ներկայացուցիչ BF (մոխրագույն մասշտաբի վահանակներ) և CF (աջ վահանակներ, AF488-ով պիտակավորված αS կանաչով) 100 μM αS (1% ֆլուորեսցենտային պիտակ) պարունակող 100 μM αS (1% լյումինեսցենտային պիտակ) LLPS բուֆերում՝ 100 μM Tau441 (վերևի) ֆլուորեսցենտային ΔNt պատկերների առկայությամբ: - Tau (կենտրոն) կամ 1 mM pLK (ներքև) տարբեր ինկուբացիոն ժամանակներում և կիզակետային բարձրություններում (z, հեռավորությունը ափսեի հատակից):Փորձերը կրկնվել են 4-6 անգամ միմյանցից անկախ՝ նույն արդյունքներով։αS/Tau441 կոացերվատները թրջվում են 24 ժամ հետո՝ կազմելով պատկերից ավելի մեծ լաստանավներ:Բոլոր պատկերների սանդղակը 20 մկմ է:
Այնուհետև մենք հարցրինք, թե արդյոք αS/Tau441 LLPS-ում ձևավորված մեծ հեղուկի նման սպիտակուցային լողավազանները կհանգեցնեն ուսումնասիրված սպիտակուցներից որևէ մեկի ամիլոիդային ագրեգացման:Մենք ժամանակի ընթացքում հետևեցինք αS/Tau441 կաթիլների հասունացմանը WF մանրադիտակով նույն պայմաններում, ինչ վերևում, բայց օգտագործելով 1 μM AF488 պիտակավորված αS և Atto647N պիտակավորված Tau441 (նկ. 5ա):Ինչպես և սպասվում էր, հասունացման ողջ ընթացքում մենք նկատեցինք սպիտակուցի ամբողջական տեղայնացում:Հետաքրքիր է, որ մոտ.5 ժամ հետո լաստանավների ներսում նկատվեցին ավելի ինտենսիվ ոչ շրջանաձև կառուցվածքներ, որոնք մենք անվանեցինք «կետեր», որոնց մի մասը համախմբված էր αS-ով, իսկ մի մասը հարստացավ Tau441-ով (նկ. 5ա, սպիտակ սլաքներ):Այս բծերը միշտ նկատվել են լաստանավերի ներսում αS/ΔNt-Tau-ի համար ավելի մեծ չափով, քան αS/ΔNt-Tau-ի համար:pLK և Tau համակարգերի կաթիլներում չկան հստակ բծեր, որոնք ունակ չեն միաձուլման/թրջման համար:Փորձելու համար, թե արդյոք αS և Tau441 պարունակող այս բծերը ամիլոիդային ագրեգատներ են, մենք նմանատիպ փորձ կատարեցինք CF մանրադիտակի միջոցով, որտեղ Tau441-ը պիտակավորված էր Atto647N-ով, իսկ 12,5 μM ամիլոիդին հատուկ թիոֆլավին-T (ThT) ավելացվեց սկզբից:ներկանյութ.Թեև αS/Tau441 կաթիլների կամ լաստանավների ThT ներկում չի նկատվել նույնիսկ ինկուբացիայից 24 ժամ հետո (նկ. 5b, վերին շարք. մնացած կաթիլները սպիտակուցային լաստանավների վրա), ThT-դրական կառուցվածքները, որոնք պարունակում են Atto647N-Tau441 լաստանավերի ներսում, շատ թույլ էին:սա կրկնում է նախկինում նկարագրված բծերի չափը, ձևը և գտնվելու վայրը (նկ. 5b, միջին և ներքևի շարքեր), ինչը ենթադրում է, որ բծերը կարող են համապատասխանել ամիլոիդի նման ագրեգատներին, որոնք ձևավորվել են ծերացող հեղուկի կոացերվատներում:
WF 25 μM αS տարբեր ինկուբացիոն ժամանակներում և կիզակետային բարձրություններում (z, հեռավորությունը չկապված հատակից) 25 μM Tau441 (1 μM AF488 պիտակավորված αS և Atto647N պիտակավորված Tau441) առկայության դեպքում մանրադիտակի ափսեի ջրհորի մեջ LLPS բուֆերով) .Նմանատիպ արդյունքներով ինքնուրույն կրկնվել են վեց փորձեր:b CF 25 μM αS-ի մանրադիտակային պատկերը 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N պիտակավորված Tau441) և 12,5 μM թիոֆլավին-T (ThT) առկայության դեպքում:Վերին և միջին շարքերում համապատասխանաբար ցուցադրված են սպիտակուցի կշռված կաթիլները և նստած սպիտակուցային լաստանավներն ու բծերը:Ներքևի շարքը ցույց է տալիս լաստանավների և կաթիլների պատկերներ 3 անկախ կրկնօրինակներից:Սպիտակ սլաքները ցույց են տալիս ThT-դրական կետերը երկու վահանակներում:Բոլոր պատկերների սանդղակը 20 մկմ է:
Հեղուկից պինդ անցման ժամանակ կոացերվատ սպիտակուցային ցանցի փոփոխությունները ավելի մանրամասն ուսումնասիրելու համար մենք օգտագործեցինք ֆլյուորեսցենտային պատկերացում (FLIM) և Ֆորստերի ռեզոնանսային էներգիայի փոխանցման մանրադիտակ (FRET) (Նկար 6 և լրացուցիչ նկարներ 8 և 9):Մենք ենթադրեցինք, որ շերտի համակցված հասունացումը ավելի խտացված կամ նույնիսկ պինդ նման ագրեգացված սպիտակուցային կառուցվածքի հանգեցնում է ավելի սերտ շփման սպիտակուցի և դրան կցված լյումինեսցենտային զոնդի միջև՝ պոտենցիալ առաջացնելով մարման էֆեկտ, որը դրսևորվում է զոնդի կարճ ժամկետում (τ) , ինչպես նկարագրված է նախկինում40.,41 ,42.Բացի այդ, կրկնակի պիտակավորված նմուշների համար (AF488 և Atto647N որպես FRET դոնոր և ընդունող ներկանյութեր, համապատասխանաբար), τ-ի այս նվազումը կարող է ուղեկցվել նաև կոացերվատային խտացմամբ և FRET(E) արդյունավետության բարձրացմամբ LSPT-ի ժամանակ:Մենք ժամանակի ընթացքում մշտադիտարկեցինք լաստանավների և բծերի ձևավորումը LLPS αS/Tau441 և αS/ΔNt-Tau նմուշներում (յուրաքանչյուր սպիտակուցի 25 μM LLPS բուֆերում, որը պարունակում է 1 μM AF488 պիտակավորված αS և/կամ Atto647N պիտակավորված Tau441 կամ ΔNt-Tau):Մենք ընդհանուր միտում նկատեցինք, որ AF488 (τ488) և Atto647N (τ647N) զոնդերի ֆլյուորեսցենտային կյանքի տևողությունը փոքր-ինչ նվազել է, երբ կոացերվատները հասունանում էին (նկ. 6 և լրացուցիչ նկ. 8c):Հետաքրքիր է, որ այս փոփոխությունը զգալիորեն ընդլայնվել է լաստանավների ներսում գտնվող կետերի համար (նկ. 6c), ինչը ցույց է տալիս, որ սպիտակուցների հետագա խտացումն առաջացել է կետերում:Ի պաշտպանություն դրա, 24 ժամ հնացած αS/ΔNt-Tau կաթիլների համար ֆլուորեսցենտային կյանքի տեւողության զգալի փոփոխություն չի նկատվել (Լրացուցիչ Նկար 8d), ինչը ենթադրում է, որ կաթիլային ժելացումը տարբերվում է խայտաբղետից և չի ուղեկցվում էական մոլեկուլային վերակազմակերպմամբ: կոասերվատների շրջանակներում:Հարկ է նշել, որ αS-ում կետերն ունեն տարբեր չափեր և փոփոխական բովանդակություն, հատկապես αS/Tau441 համակարգի համար (Լրացուցիչ նկար 8e):Կետային ֆլուորեսցենտային կյանքի տևողության նվազումը ուղեկցվել է ինտենսիվության աճով, հատկապես Atto647N պիտակավորված Tau441-ի համար (Լրացուցիչ Նկ. 8ա) և FRET-ի ավելի բարձր արդյունավետությամբ և αS/Tau441 և αS/ΔNt-Tau համակարգերի համար, ինչը ցույց է տալիս հետագա խտացում LLPS հինգ ժամում: գործարկումից հետո ստատիկ էլեկտրականության ներսում գտնվող սպիտակուցները խտացել են:αS/ΔNt-Tau-ի համեմատ՝ αS/Tau441 կետերում մենք նկատեցինք τ647N ավելի ցածր և մի փոքր ավելի բարձր τ488 արժեքներ, որոնք ուղեկցվում էին ավելի ցածր և ավելի անհամասեռ FRET արժեքներով:Հնարավոր է, դա կապված է այն փաստի հետ, որ αS/Tau441 համակարգում ագրեգատներում αS-ի դիտարկված և սպասվող առատությունը ավելի տարասեռ է, հաճախ ենթաստոքիոմետրիկ՝ համեմատած Tau-ի հետ, քանի որ Tau441-ը նույնպես կարող է ենթարկվել LLPS և ագրեգացման (Լրացուցիչ նկար 8e) .Այնուամենայնիվ, կաթիլների միաձուլման աստիճանը, լաստանավի ձևավորումը և, կարևորը, սպիտակուցի ագրեգացումը հեղուկանման կոացերվատներում առավելագույնն է, երբ առկա են և՛ Tau441, և՛ αS:
αS/Tau441-ի և αS/ΔNt-Tau-ի ողջ կյանքի ֆլյուորեսցենտային մանրադիտակի (FLIM) պատկերները յուրաքանչյուր սպիտակուցի 25 մկմ (1 μM AF488 պիտակավորված αS և 1 μM Atto647N պիտակավորված Tau441 կամ ΔNt-Tau) LLPS բուֆերում:Սյունակները ցույց են տալիս LLPS նմուշների ներկայացուցչական պատկերները հասունացման տարբեր ժամանակներում (30 րոպե, 5 ժամ և 24 ժամ):Կարմիր շրջանակը ցույց է տալիս αS/Tau441 բծեր պարունակող շրջանը:Կյանքի տևողությունը ցուցադրվում է որպես գունավոր գծեր:Սանդղակի սանդղակ = 20 մկմ բոլոր պատկերների համար:b Ընտրված տարածքի մեծացված FLIM պատկերը, որը ցուցադրված է վահանակի կարմիր վանդակում a:Կյանքի միջակայքերը ցուցադրվում են՝ օգտագործելով նույն գունային սանդղակը, ինչ վահանակում a:Սանդղակի սանդղակը = 5 մկմ:գ Հիստոգրամներ, որոնք ցույց են տալիս AF488 (կցված αS-ին) կամ Atto647N (կցված է Tau-ին) տարբեր սպիտակուցային տեսակների համար (կաթիլներ-D-, լաստանավ-R- և բծեր-P), որոնք հայտնաբերված են αS-ի համար գրանցված FLIM պատկերներում) ժամանակային բաշխման Tau441 և կյանքի տևողությունը: αS/ΔNt-Tau համակցված նմուշներ (N = 17-32 ROI D-ի համար, 29-44 ROI R-ի համար և 21-51 ROI կետերի համար):Միջին և միջին արժեքները ցուցադրվում են համապատասխանաբար որպես դեղին քառակուսիներ և սև գծեր վանդակների ներսում:Տուփի ստորին և վերին սահմանները ներկայացնում են համապատասխանաբար առաջին և երրորդ քառորդները, իսկ նվազագույն և առավելագույն արժեքները 1,5 անգամ միջքառորդական միջակայքի (IQR) սահմաններում ցուցադրվում են բեղերի տեսքով:Outliers ցուցադրվում են որպես սև ադամանդներ:Բաշխումների զույգերի միջև վիճակագրական նշանակությունը որոշվել է երկու նմուշի t-թեստի միջոցով՝ ենթադրելով անհավասար շեղումներ:Երկու պոչ t-test p-արժեքները ցուցադրվում են աստղանիշներով յուրաքանչյուր զույգ համեմատվող տվյալների համար (* p-արժեք > 0.01, ** p-արժեք > 0.001, *** p-արժեք > 0.0001, **** p-value > 0.00001), ns Նշում է աննշանությունը (p-արժեք > 0.05):Ճշգրիտ p արժեքները տրված են Լրացուցիչ Աղյուսակ 1-ում, իսկ սկզբնական տվյալները ներկայացված են որպես չմշակված տվյալների ֆայլեր:
Բծերի/ագրեգատների ամիլոիդային բնույթը հետագայում ցուցադրելու համար մենք 24 ժամ մշակեցինք չներկված կոացերվատ նմուշները (1 M) NaCl-ի բարձր կոնցենտրացիաներով, ինչը հանգեցրեց ագրեգատների բաժանմանը սպիտակուցային կոացերվատներից:Երբ մեկուսացված ագրեգատներ (այսինքն՝ ագրեգատների ցրված լուծույթ) դիտարկվեցին ատոմային ուժային մանրադիտակի (AFM) միջոցով, մենք նկատեցինք հիմնականում գնդաձև մորֆոլոգիա՝ մոտ 15 նմ կանոնավոր բարձրությամբ, որը հակված է կապվել աղի բարձր կոնցենտրացիայի պայմաններում, նման տիպիկ ամիլոիդ մանրաթելերի վարքագիծը մակերեսի վրա ուժեղ հիդրոֆոբ ազդեցության պատճառով (նկատի ունեցեք, որ մանրաթելերը սովորաբար ունեն ~10 նմ բարձրություն) (Լրացուցիչ նկար 10ա):Հետաքրքիր է, որ երբ մեկուսացված ագրեգատները ինկուբացվում էին ThT-ով ստանդարտ ThT ֆլյուորեսցենտային վերլուծության մեջ, մենք նկատեցինք ThT ֆլուորեսցենցիայի քվանտային ելքի կտրուկ աճ, որը համեմատելի էր այն ցուցանիշի հետ, որը դիտվում էր, երբ ներկը ինկուբավորվում էր բնորոշ αS ամիլոիդ մանրաթելերով (Լրացուցիչ Նկ. 10): կոացերվատ ագրեգատները պարունակում են ամիլոիդային կառուցվածքներ:.Իրականում, ագրեգատները հանդուրժող էին աղի բարձր կոնցենտրացիաների նկատմամբ, սակայն զգայուն էին 4 M գուանիդին քլորիդին (GdnHCl), ինչպես բնորոշ ամիլոիդ մանրաթելերը (Լրացուցիչ նկար 10c):
Այնուհետև մենք վերլուծեցինք ագրեգատների բաղադրությունը՝ օգտագործելով մեկ մոլեկուլային ֆլուորեսցենտություն, հատուկ ֆլուորեսցենտային հարաբերակցություն/խաչհարաբերակցման սպեկտրոսկոպիա (FCS/FCCS) և երկու գույների համընկնման հայտնաբերման պայթեցման վերլուծություն (TCCD):Այդ նպատակով մենք առանձնացրեցինք ագրեգատները, որոնք ձևավորվել էին 24 ժամ ինկուբացիայից հետո 100 μl LLPS նմուշներում, որոնք պարունակում էին αS և Tau441 (երկուսն էլ 25 μM) 1 μM AF488 պիտակավորված αS և 1 μM Atto647N պիտակավորված Tau441:Ստացված ցրված ագրեգատի լուծույթը նոսրացրեք մինչև մոնոմոլեկուլային վիճակ՝ օգտագործելով նույն PEG-ից զերծ բուֆերը և 1 M NaCl (նույն բուֆերը, որն օգտագործվում է ագրեգատները կոացերվատից առանձնացնելու համար)՝ LLPS-ի և սպիտակուցի միջև հնարավոր էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությունները կանխելու համար:Մեկ մոլեկուլի ժամանակային հետագծի օրինակ կարելի է տեսնել Նկար 7ա-ում:FCCS/FCS վերլուծությունը (խաչհարաբերակցություն, CC և ավտոկոռելացիա, AC) ցույց տվեց, որ αS և tau պարունակող ագրեգատները առատ էին նմուշներում (տես CC կորը Նկար 7b-ում, ձախ վահանակում), և մնացորդային մոնոմերային սպիտակուցի ավելցուկ առաջացավ որպես նոսրացման գործընթացի արդյունքը (տես AC կորերը Նկար 7b-ում, ձախ վահանակում):Միայն մոնոմերային սպիտակուցներ պարունակող նմուշների վերահսկման փորձերը, որոնք իրականացվել են լուծույթի նույն պայմաններում, չեն ցույց տվել CC կորեր, և AC կորերը լավ տեղավորվում են մեկ բաղադրիչ դիֆուզիոն մոդելի հետ (Հավասարում 4), որտեղ մոնոմերային սպիտակուցներն ունեն ակնկալվող դիֆուզիոն գործակիցներ (նկ. 7b): ), աջ վահանակ):Ագրեգացված մասնիկների դիֆուզիայի գործակիցը 1 մկմ2/վ-ից պակաս է, իսկ մոնոմերային սպիտակուցներինը՝ մոտ 1 մկմ2/վ։50–100 մկմ/վրկ;արժեքները նման են նախկինում հրապարակված արժեքներին՝ լուծույթի նմանատիպ պայմաններում առանձին-առանձին հնչյունավորված αS ամիլոիդային մանրաթելերի և մոնոմերային αS-ի համար44:Երբ մենք վերլուծեցինք ագրեգատները TCCD պայթյունի վերլուծությամբ (նկ. 7c, վերին վահանակ), մենք պարզեցինք, որ յուրաքանչյուր մեկուսացված ագրեգատում (αS/Tau հետերոագրեգատ) հայտնաբերված ագրեգատների մոտ 60%-ը պարունակում էր և αS և tau, մոտ 30%-ը պարունակում էր միայն tau, մոտ 10% αS միայն:αS/Tau հետերոագրեգատների ստոյխիոմետրիկ վերլուծությունը ցույց է տվել, որ հետերոագրեգատների մեծ մասը հարստացել է տաու-ով (ստոկիոմետրիա 0,5-ից ցածր, տաու մոլեկուլների միջին թիվը մեկ ագրեգատում 4 անգամ ավելի է, քան αS մոլեկուլները), ինչը համահունչ է FLIM in situ-ում դիտված մեր աշխատանքին: փորձարկումներ..FRET վերլուծությունը ցույց է տվել, որ այս ագրեգատները պարունակում են երկու սպիտակուցներ, թեև FRET-ի իրական արժեքներն այս դեպքում մեծ նշանակություն չունեն, քանի որ յուրաքանչյուր ագրեգատի մեջ ֆտորոֆորների բաշխումը պատահական է եղել փորձի ժամանակ օգտագործված չպիտակավորված սպիտակուցի ավելցուկի պատճառով:Հետաքրքիր է, որ երբ մենք կատարեցինք նույն անալիզը, օգտագործելով 45,46 հասուն ամիլոիդային ագրեգացիայի պակաս Tau տարբերակը (տես Լրացուցիչ Նկար 11a,b), մենք նկատեցինք, որ չնայած αS էլեկտրաստատիկ ագրեգացիան նույնն էր (Լրացուցիչ նկ. 11c, d), կոացերվատի ներսում ագրեգատներ ձևավորելու ունակությունը կտրուկ նվազեց, և FLIM-ը հայտնաբերեց մի քանի բծեր in situ փորձարկումներում, և մեկուսացված ագրեգատ նմուշների համար նկատվեցին թույլ խաչաձև հարաբերակցության կորեր:Այնուամենայնիվ, հայտնաբերված ագրեգատների փոքր քանակի համար (Tau441-ի միայն մեկ տասներորդը), մենք նկատեցինք, որ յուրաքանչյուր ագրեգատ հարստացել է αS-ով, քան այս Tau տարբերակը, և հայտնաբերված ագրեգատների մոտավորապես 50%-ը պարունակում է միայն αS մոլեկուլներ, և αS-ն ավելցուկով տարասեռ է: .ագրեգատներ (տես Լրացուցիչ նկ. 11e), ի տարբերություն Tau441-ի կողմից առաջացած տարասեռ ագրեգատների (նկ. 6f):Այս փորձերի արդյունքները ցույց տվեցին, որ չնայած αS-ն ինքնին ունակ է կուտակվել տաուով կոացերվատի ներսում, տաու միջուկավորումն ավելի բարենպաստ է այս պայմաններում, և արդյունքում ստացված ամիլոիդային ագրեգատները կարող են հանդես գալ որպես αS-ի և tau-ի ձև:Այնուամենայնիվ, երբ ձևավորվում է տաուով հարուստ միջուկ, αS-ի և tau-ի միջև հետերոտիպային փոխազդեցությունները ագրեգատներում գերադասելի են, քան տաու մոլեկուլների միջև հոմոտիպիկ փոխազդեցությունները;Մենք նաև դիտում ենք սպիտակուցային ցանցեր հեղուկ αS/tau կոացերվատներում:
աS/Tau441 էլեկտրաստատիկ կոացերվատներում ձևավորված մեկուսացված ագրեգատների առանձին մոլեկուլների ներկայացուցչական ֆլուորեսցենտային ժամանակային հետքեր:αS/Tau441 կոագգրեգատներին համապատասխան պոռթկումներ (նշված շեմից բարձր պայթյուններ) նկատվել են երեք հայտնաբերման ուղիներում (AF488 և Atto647N արտանետում ուղղակի գրգռումից հետո, կապույտ և կարմիր գծեր, Atto647N արտանետում անուղղակի գրգռումից հետո), FRET, մանուշակագույն գիծ):b LLPS-ից (ձախ վահանակ) ստացված αS/Tau441 մեկուսացված ագրեգատների նմուշի FCS/FCCS վերլուծություն:AF488-ի և Atto647N-ի ավտոկոռելյացիայի (AC) կորերը համապատասխանաբար ցուցադրված են կապույտ և կարմիր, իսկ խաչաձև հարաբերակցության (CC) կորերը՝ կապված երկու ներկեր պարունակող ագրեգատների հետ՝ մանուշակագույնով:AC կորերը արտացոլում են պիտակավորված մոնոմերային և ագրեգացված սպիտակուցային տեսակների առկայությունը, մինչդեռ CC կորերը ցույց են տալիս միայն կրկնակի պիտակավորված ագրեգատների տարածումը:Նույն անալիզը, բայց լուծույթի նույն պայմաններում, ինչ մեկուսացված կետերում, նմուշները, որոնք պարունակում են միայն մոնոմեր αS և Tau441, ցուցադրվում են որպես հսկիչներ աջ վահանակում:c αS/Tau441 էլեկտրաստատիկ կոացերվատներում ձևավորված մեկուսացված ագրեգատների առանձին մոլեկուլների ֆլյուորեսցենտային ֆլեշ անալիզ:Չորս տարբեր կրկնություններում հայտնաբերված յուրաքանչյուր ագրեգատի մասին տեղեկատվությունը (N = 152) գծագրվում է դրանց ստոիքիոմետրիայի, S արժեքների և FRET արդյունավետության համեմատ (վերևի վահանակը, գունային գոտին արտացոլում է առաջացումը):Կարելի է առանձնացնել ագրեգատների երեք տեսակ՝ -αS-միայն S~1 և FRET~0 ագրեգատներ, միայն Tau-ի ագրեգատներ S~0 և FRET~1-ով և տարասեռ Tau/αS ագրեգատներ միջանկյալ S-ով և FRET-ով: Յուրաքանչյուր տարասեռ ագրեգատի մեջ հայտնաբերված երկու մարկերային սպիտակուցները (N = 100) ցուցադրված են ստորին վահանակում (գունային սանդղակը արտացոլում է առաջացումը):Հում տվյալները տրամադրվում են չմշակված տվյալների ֆայլերի տեսքով:
Հեղուկ սպիտակուցի կոնդենսատների հասունացումը կամ ծերացումը ժամանակի ընթացքում գելանման կամ պինդ կառուցվածքների վերածվում է կոնդենսատի մի շարք ֆիզիոլոգիական ֆունկցիաների47, ինչպես նաև հիվանդության, որպես աննորմալ գործընթաց, որը նախորդում է ամիլոիդային ագրեգացմանը 7, 48, 49: Այստեղ մենք մանրամասն ուսումնասիրում ենք փուլերի տարանջատումը և վարքագիծը:LSPT αS պատահական պոլիկատիոնների առկայության դեպքում վերահսկվող միջավայրում՝ ցածր միկրոմոլային կոնցենտրացիաներով և ֆիզիոլոգիապես համապատասխան պայմաններով (նկատի ունեցեք, որ αS-ի հաշվարկված ֆիզիոլոգիական կոնցենտրացիան >1 μM50 է), հետևելով LPS-ի տիպիկ թերմոդինամիկորեն պայմանավորված վարքագծին:Մենք պարզեցինք, որ αS-ը, որը պարունակում է խիստ բացասական լիցքավորված C-տերմինալ շրջան ֆիզիոլոգիական pH-ով, կարող է սպիտակուցներով հարուստ կաթիլներ ձևավորել ջրային լուծույթում LLPS-ի միջոցով բարձր կատիոնային խանգարված պեպտիդների առկայության դեպքում, ինչպիսիք են pLK-ն կամ Tau-ն՝ էլեկտրաստատիկ գործընթացի միջոցով: բարդ խտացում ագրեգացիոն մակրոմոլեկուլների առկայության դեպքում:Այս գործընթացը կարող է համապատասխան ազդեցություն ունենալ բջջային միջավայրում, որտեղ αS-ը հանդիպում է տարբեր պոլիկատիոնային մոլեկուլների՝ կապված իր հիվանդության հետ կապված ագրեգացիայի հետ և՛ in vitro, և՛ in vivo51,52,53,54:
Բազմաթիվ ուսումնասիրություններում կաթիլների մեջ սպիտակուցի դինամիկան դիտարկվել է որպես հասունացման գործընթացը որոշող հիմնական գործոններից մեկը55,56:Պոլիկատիոնների հետ էլեկտրաստատիկ αS կոացերվատներում հասունացման գործընթացը, ըստ երևույթին, կախված է պոլիկատիոնների հետ փոխազդեցությունների ուժից, վալենտությունից և այդ փոխազդեցությունների բազմությունից:Հավասարակշռության տեսությունը ենթադրում է, որ երկու հեղուկ վիճակների հավասարակշռության լանդշաֆտը կլինի մեծ կաթիլների առկայությունը, որը հարուստ է կենսապոլիմերներով, որոնք մղում են LLPS57,58:Կաթիլների աճը կարող է հասնել Օստվալդի հասունացման59, միաձուլման60 կամ ցրված փուլում ազատ մոնոմերի սպառման միջոցով61:αS-ի և Tau441-ի, ΔNt-Tau-ի կամ pLK-ի համար սպիտակուցի մեծ մասը կենտրոնացված էր կոնդենսատում այս ուսումնասիրության մեջ օգտագործված պայմաններում:Այնուամենայնիվ, թեև տաու-ի լրիվ չափի կաթիլները արագորեն միավորվում էին մակերևույթի թրջման ժամանակ, կաթիլների միաձուլումը և թրջումը դժվար էր ΔNt-Tau-ի և pLK-ի համար, ինչը ենթադրում է հեղուկի հատկությունների արագ կորուստ այս երկու համակարգերում:Ըստ մեր FLIM-FRET վերլուծության, ծերացած pLK և ΔNt-Tau կաթիլները ցույց են տվել սպիտակուցի ագրեգացման նույն աստիճանը (նման ֆլյուորեսցենտային կյանքի տևողությունը), ինչպես սկզբնական կաթիլները, ինչը ենթադրում է, որ սկզբնական սպիտակուցային ցանցը պահպանվել է, թեև ավելի կոշտ:
Մենք ռացիոնալացնում ենք մեր փորձարարական արդյունքները հետևյալ մոդելում (Նկար 8):Սկզբում ժամանակավոր ձևավորված կաթիլները հաճախ սպիտակուցային ցանցեր են՝ առանց էլեկտրաստատիկ փոխհատուցման, և, հետևաբար, կան լիցքի անհավասարակշռության տարածքներ, հատկապես կաթիլների միջերեսում, ինչը հանգեցնում է բարձր էլեկտրաստատիկ մակերևույթի պոտենցիալ ունեցող կաթիլների:Լիցքը փոխհատուցելու (երևույթ, որը սովորաբար կոչվում է վալենտական ​​սպառում) և նվազագույնի հասցնելու կաթիլների մակերեսային ներուժը, կաթիլները կարող են ներառել նոր պոլիպեպտիդներ նոսր փուլից, վերակազմավորել սպիտակուցային ցանցերը՝ օպտիմալացնելու լիցք-լիցք փոխազդեցությունը և փոխազդել այլ կաթիլների հետ:մակերեսներով (թրջող)։αS/pLK կաթիլները, իրենց ավելի պարզ սպիտակուցային ցանցի (միայն հետերոտիպիկ փոխազդեցություններ αS-ի և pLK-ի միջև) և սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցության ավելի մեծ հարաբերակցության շնորհիվ, թվում է, որ կարողանում են ավելի արագ հավասարակշռել կոնդենսատի լիցքը.իսկապես, մենք նկատեցինք ավելի արագ սպիտակուցի կինետիկա սկզբնական ձևավորված αS/pLK կոացերվատներում, քան αS/Tau-ում:Վալենտականության սպառումից հետո փոխազդեցությունները դառնում են ավելի քիչ անցողիկ, և կաթիլները կորցնում են իրենց հեղուկ հատկությունները և վերածվում գելման, ոչ դյուրավառ կաթիլների՝ ցածր էլեկտրաստատիկ մակերևույթի պոտենցիալով (և, հետևաբար, չեն կարողանում թրջել մակերեսը):Ի հակադրություն, αS/Tau կաթիլներն ավելի քիչ արդյունավետ են կաթիլների լիցքավորման հավասարակշռությունը օպտիմալացնելու համար՝ պայմանավորված ավելի բարդ սպիտակուցային ցանցերով (ինչպես հոմոտիպիկ, այնպես էլ հետերոտիպիկ փոխազդեցություններով) և սպիտակուցային փոխազդեցությունների ավելի թույլ բնույթով:Սա հանգեցնում է կաթիլների, որոնք պահպանում են հեղուկի վարքը երկար ժամանակ և ցուցադրում են բարձր էլեկտրաստատիկ մակերևույթի պոտենցիալ, որը ձգտում է նվազագույնի հասցնել միաձուլման և աճի միջոցով (այդպիսով նվազագույնի հասցնելով կաթիլների մակերես/ծավալ հարաբերակցությունը) և խոնավացնելով հիդրոֆիլ մակերեսի քիմ.Սա ստեղծում է խոշոր կենտրոնացված սպիտակուցային գրադարաններ, որոնք պահպանում են հեղուկի հատկությունները, քանի որ փոխազդեցությունները մնում են շատ անցողիկ՝ սպիտակուցային ցանցում լիցքի օպտիմալացման մշտական ​​որոնման պատճառով:Հետաքրքիր է, որ Tau-ի N-տերմինալ կտրված ձևերը, ներառյալ որոշ բնական իզոֆորմներ62, դրսևորում են միջանկյալ վարքագիծ, երբ որոշ կոացերվատներ αS-ով ծերանում են և վերածվում երկարակյաց գելման կաթիլների, իսկ մյուսները վերածվում են մեծ հեղուկ կոնդենսատների:αS էլեկտրաստատիկ կոացերվատների հասունացման այս երկակիությունը համահունչ է LLPS-ի վերջին տեսական և փորձարարական ուսումնասիրություններին, որոնք հայտնաբերել են փոխկապակցվածություն վալենտային սպառման և կոնդենսատներում էլեկտրաստատիկ մաղման միջև՝ որպես կոնդենսատի չափի և հեղուկի հատկությունների վերահսկման բանալին:Մեխանիզմ 58.61.
Այս սխեման ցույց է տալիս αS-ի և Tau441-ի ենթադրյալ ամիլոիդի ագրեգացման ուղին LLPS-ի և LSPT-ի միջոցով:Լրացուցիչ անիոններով հարուստ (կարմիր) և կատիոններով հարուստ (կապույտ) շրջաններով αS և տաու էլեկտրաստատիկ կոացերվատները բավարար վալենտությամբ ունեն ավելի ցածր մակերևութային էներգիա և, հետևաբար, ավելի քիչ միաձուլում, ինչը հանգեցնում է կաթիլների արագ ծերացմանը:Ստացվում է կայուն ոչ ագլոմերացված գելային վիճակ:.Այս իրավիճակը շատ բարենպաստ է αS/pLK համակարգի դեպքում՝ շնորհիվ նրա ավելի բարձր մերձեցման և սպիտակուց-զույգ փոխազդեցության ավելի պարզ ցանցի, որը թույլ է տալիս արագ գելանման անցում:Ընդհակառակը, անբավարար վալենտություն ունեցող կաթիլները և, հետևաբար, սպիտակուցներով լիցքավորված շրջանները, որոնք հասանելի են փոխազդեցության համար, հեշտացնում են կոացերվատի միաձուլումը և խոնավացումը հիդրոֆիլ մակերեսը, որպեսզի նվազեցնի դրա բարձր մակերեսային էներգիան:Այս իրավիճակը նախընտրելի է αS/Tau441 կոացերվատների համար, որոնք ունեն բազմավալենտ բարդ ցանց՝ բաղկացած թույլ Tau-Tau և αS-Tau փոխազդեցություններից։Իր հերթին, ավելի մեծ կոացերվատները ավելի հեշտությամբ կպահպանեն իրենց հեղուկի նման հատկությունները, ինչը թույլ կտա այլ փոխազդեցություններ սպիտակուցի և սպիտակուցի հետ:Ի վերջո, ամիլոիդ հետերոգեն ագրեգատները, որոնք պարունակում են և αS, և տաու, ձևավորվում են կոացերվատ հեղուկի ներսում, որոնք կարող են կապված լինել ներառական մարմիններում հայտնաբերվածների հետ, որոնք նեյրոդեգեներատիվ հիվանդությունների բնորոշ նշաններ են:
Հեղուկի նման մեծ կառուցվածքները, որոնք ձևավորվել են αS/Tau441-ի հասունացման ժամանակ՝ բարձր գերծանրաբեռնված, բայց դինամիկ սպիտակուցային միջավայրով և, ավելի քիչ, αS/ΔNt-Tau կոացերվատները իդեալական ջրամբարներ են սպիտակուցի ագրեգացիայի միջուկավորման համար:Մենք իսկապես դիտարկել ենք սպիտակուցի պինդ ագրեգատների ձևավորումը այս տեսակի սպիտակուցային կոացերվատներում, որոնք հաճախ պարունակում են ինչպես αS, այնպես էլ տաու:Մենք ցույց ենք տվել, որ այս հետերոագրեգատները կայունանում են ոչ էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությունների արդյունքում, կարող են կապել ամիլոիդային հատուկ ThT ներկերը նույն ձևով, ինչ բնորոշ ամիլոիդ մանրաթելերը, և իսկապես ունեն նմանատիպ դիմադրություն տարբեր ազդեցությունների նկատմամբ:Ցույց է տրվել, որ LLPS-ով ձևավորված αS/tau ագրեգատներն ունեն ամիլոիդային հատկություններ:Իրոք, ամիլոիդային ագրեգացման պակաս ունեցող Tau-ի հասուն տարբերակը զգալիորեն խաթարված է այս տարասեռ αS ագրեգատների ձևավորման մեջ հեղուկ էլեկտրաստատիկ կոացերվատի ներսում:αS/Tau441 ագրեգատների առաջացումը նկատվել է միայն կոացերվատների ներսում, որոնք պահպանել են հեղուկանման հատկություններ, և երբեք, եթե կոացերվատները/կաթիլները չեն հասել գելային վիճակի:Վերջին դեպքում էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությունների ուժեղացումը և, որպես հետևանք, սպիտակուցային ցանցի կոշտությունը կանխում են սպիտակուցների անհրաժեշտ կոնֆորմացիոն վերադասավորումները՝ ամիլոիդի միջուկացման համար անհրաժեշտ սպիտակուցային նոր փոխազդեցությունների հաստատման համար:Այնուամենայնիվ, դրան կարելի է հասնել ավելի ճկուն, հեղուկանման կոացերվատներում, որոնք, իր հերթին, ավելի հավանական է, որ կմնան հեղուկ, քանի որ դրանք մեծանում են:
Այն փաստը, որ խտացված փուլում ագրեգատների ձևավորումը նախընտրելի է մեծ αS/Tau կոնդենսատներում, քան փոքր կաթիլներում, որոնք արագորեն գել են, ընդգծում է կաթիլների միաձուլումը վերահսկող գործոնների նույնականացման կարևորությունը:Այսպիսով, ոչ միայն կա փուլային տարանջատման միտում, այլև կոնդենսատի չափը պետք է վերահսկվի պատշաճ գործելու, ինչպես նաև հիվանդությունների կանխարգելման համար58,61:Մեր արդյունքները նաև ընդգծում են LLPS-ի և LSPT-ի միջև հավասարակշռության կարևորությունը αS/Tau համակարգի համար:Թեև կաթիլների ձևավորումը կարող է պաշտպանել ամիլոիդի ագրեգացիայից՝ նվազեցնելով հագեցվածության պայմաններում առկա սպիտակուցային մոնոմերների քանակը, ինչպես առաջարկվել է այլ համակարգերում63,64, կաթիլների միաձուլումը կաթիլների բարձր մակարդակներում կարող է հանգեցնել սպիտակուցի ներքին ագրեգացման՝ դանդաղ կոնֆորմացիոն վերադասավորումների միջոցով:սպիտակուցային ցանցեր..
Ընդհանուր առմամբ, մեր տվյալները խստորեն ընդգծում են համակցված վալենտության և գոհ/չբավարարված փոխազդեցությունների արդիականությունը կաթիլային ցանցերում LSPT-ի համատեքստում:Մասնավորապես, մենք ցույց ենք տալիս, որ αS/Tau441 ամբողջական երկարությամբ կոնդենսատները կարող են արդյունավետորեն միաձուլվել և ձևավորվել ամիլոիդային հետերոագրեգատներ, որոնք ներառում են և՛ սպիտակուցներ, և՛ առաջարկում են մոլեկուլային մեխանիզմ՝ հիմնված մեր փորձարարական արդյունքների վրա:Երկու սպիտակուցների համախմբումը αS/Tau հեղուկի կոացերվատում, որը մենք հայտնում ենք այստեղ, իսկապես կարող է կապված լինել երկու սպիտակուցների համատեղ տեղայնացման հետ, որոնք հիվանդության բնորոշ նշաններն են, և կարող է նպաստել LLPS-ի և փոխհարաբերությունների ըմբռնմանը: ամիլոիդային ագրեգացիա, որը ճանապարհ է հարթում նեյրոդեգեներացիայի ժամանակ բարձր լիցքավորված ՄԶԾ-ի համար:
Մոնոմերային WT-αS, ցիստեին մուտանտները (Q24C-αS, N122C-αS) և ΔCt-αS տարբերակները (Δ101-140) արտահայտվել են E. coli-ում և մաքրվել, ինչպես նախկինում նկարագրված է:5 մՄ DTT-ը ներառվել է αS ցիստեին մուտանտների մաքրման բոլոր քայլերում՝ դիսուլֆիդային կապի ձևավորումը կանխելու համար:Tau441 իզոֆորմ (պլազմիդ ստացված Addgene #16316-ից), ΔNt-Tau տարբերակ (Δ1–150, ստացված IVA-ի կլոնավորման միջոցով CTTTAAGAAGGAGAGAGATACATATGATCGCCACACCCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC-27TCau35-2TCau3-2000-2000, 5-1500000, 2007, 5-15000000, 2013, 5-1500000, 2000,50000000000, 2000,5-150000000000 պրայմերներով) այբբենարան) E. coli մշակույթներն էին աճել է մինչև OD600 = 0.6–0.7 37°C և 180 rpm-ում, և արտահայտումն առաջացել է IPTG-ով 3 ժամ 37°C ջերմաստիճանում:Հավաքեք բջիջները 11500 xg 15 րոպե 4 °C-ում և լվացեք 150 մՄ NaCl պարունակող աղի բուֆերով:Գնդիկը նորից կասեցրեք լիզի բուֆերի մեջ (20 մլ 1 լ LB-ի համար. MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μptin μM, cope):Sonication քայլը կատարվել է սառույցի վրա 80% ամպլիտուդով 10 իմպուլսների համար (1 րոպե միացված, 1 րոպե անջատում):Մեկ ուլտրաձայնային ժամանակ չպետք է գերազանցի 60 մլ-ը:E. coli-ի լիզատները 20 րոպե տաքացրին 95°C-ում, այնուհետև սառեցրին սառույցի վրա և ցենտրիֆուգեցին 127000×g-ում 40 րոպե:Հստակեցված վերին նյութը կիրառվել է 3,5 կԴա հզորությամբ թաղանթի վրա (Spectrum ™ Thermo Fisher Scientific, UK) և դիալիզացվել 4 լ դիալիզի բուֆերի նկատմամբ (20 մՄ MES, pH 6,8, NaCl 50 մՄ, EDTA 1 մՄ, MgCl2 2 մՄ, DTT): , PMSF 0.1 մՄ) 10 ժամ:5 մլ կատիոնափոխանակման սյունը (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, ԱՄՆ) հավասարեցվել է հավասարակշռման բուֆերի հետ (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF):Տաուլիզատը զտվել է 0,22 մկմ PVDF ֆիլտրի միջով և ներարկվել սյունակում 1 մլ/րոպե հոսքի արագությամբ:Էլյուցիան իրականացվել է աստիճանաբար, tau-ն զտվել է 15–30% էլուցիոն բուֆերով (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF):Ֆրակցիաները վերլուծվել են SDS-PAGE-ով, և տաուի ակնկալվող մոլեկուլային քաշով մեկ շերտ պարունակող ցանկացած ֆրակցիան կենտրոնացվել է 10 կԴա ցենտրիֆուգային ֆիլտրի միջոցով և փոխարինվել 10 մՄ HEPES, pH 7,4, NaCl 500 մՄ և DTT 2 մՄ պարունակող բուֆերով։ սպիտակուցի վերջնական կոնցենտրացիան 100 մկմ էր:Այնուհետև սպիտակուցի լուծույթն անցավ 0,22 մկմ PVDF ֆիլտրով, արագ սառեցրեց և պահվեց -80°C-ում:Protein K18-ը սիրով տրամադրեց պրոֆեսոր Ալբերտո Բոֆին:Պատրաստուկի մաքրությունը եղել է >95%, ինչպես հաստատվել է SDS-PAGE-ով և MALDI-TOF/TOF-ով:Տարբեր ցիստեիններ քիմիապես պիտակավորված էին AlexaFluor488-maleimide-ով (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ԱՄՆ) կամ TEMPOL-maleimide-ով (Toronto Research Chemicals, Տորոնտո, Կանադա):հաստատվել են կլանմամբ և MALDI-TOF/TOF-ով:Tau441-ը, ΔNt-Tau-ն, AggDef-Tau-ն և K18-ը պիտակավորվել են բնիկ ցիստեինի մնացորդներով 191 և 322 դիրքերում՝ օգտագործելով Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Գերմանիա)՝ հետևելով նույն ընթացակարգին:CIDER66-ի միջոցով ստեղծվել են αS և Tau441-ի մեկ մնացորդի համար զուտ գանձման քարտեզները:
Պինդ պոլի-L-լիզինը (pLK DP 90-110 ըստ NMR մատակարարի, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, ԱՄՆ) լուծարվել է 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4-ից 10 mM կոնցենտրացիայով, լուծարվել է 5 անգամ: րոպե ուլտրաձայնային ջրային լոգարանում և պահել -20°C ջերմաստիճանում:PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) և FITC-dextran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, ԱՄՆ) ջրում լուծվող են և լայնորեն տարածված են LLPS բուֆերում:Դիալիզը հեռացնում է աղտոտող աղերը:Այնուհետև դրանք զտվել են 0,22 մկմ ծակոտի ունեցող ներարկիչի ֆիլտրի միջով, և դրանց կոնցենտրացիաները հաշվարկվել են ռեֆրակտոմետրի միջոցով (Մեթլեր Տոլեդո, Կոլումբուս, Օհայո, ԱՄՆ):LLPS նմուշները պատրաստվել են սենյակային ջերմաստիճանում հետևյալ հաջորդականությամբ. բուֆերը և էքստրուզիան խառնվել են և 1 մՄ տրիս(2-կարբոքսիէթիլ) ֆոսֆին (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Էթան- 1, 2-դիիլդինիտրիլ) տետրաքացախաթթու (EDTA, կարբոքսինթ) և 1% պրոթեզերոնի ինհիբիտորի խառնուրդ (PMSF 100 մՄ, բենզիմիդ 1 մՄ, լեյպեպտին 5 մկմ):Այնուհետև ավելացվում են αS և միաձուլված պոլիկացիաները (տարբերակները pLK կամ Tau):Թիոֆլավին-T ժամանակային շարքերի փորձերի համար (ThT, Carbosynth, Compton, UK) օգտագործեք ThT ընդհանուր կոնցենտրացիան αS կոնցենտրացիայի կեսը:Նրբորեն, բայց մանրակրկիտ խառնեք նմուշները, որպեսզի համոզվեք, որ դրանք միատարր են:Յուրաքանչյուր բաղադրիչի կոնցենտրացիան տարբերվում էր փորձից փորձ, ինչպես նկարագրված է Արդյունքներ բաժնում:Ազիդը օգտագործվում էր 0,02% (w/v) կոնցենտրացիայի դեպքում, երբ փորձի տեւողությունը գերազանցում էր 4 ժամը:LLPS նմուշներ օգտագործող բոլոր անալիզների համար թույլ տվեք, որ խառնուրդը հավասարակշռվի վերլուծությունից 5 րոպե առաջ:Լույսի ցրման վերլուծության համար 150 մկլ նմուշները լցվեցին 96 հորատանցքի չկապող միկրոսալերի վրա (µClear®, սև, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Ավստրիա) և ծածկվեցին կպչուն թաղանթով:LLP-ները մշտադիտարկվել են՝ չափելով կլանումը 350 նմ լուծույթի կենտրոնում CLARIOstar ափսե ընթերցող սարքում (BMG Labtech, Օրտենբերգ, Գերմանիա):Փորձերն իրականացվել են եռակի անգամ 25°C ջերմաստիճանում, և սխալները հաշվարկվել են որպես միջինից ստանդարտ շեղում:Նոսրած փուլը քանակականացվել է նմուշի ցենտրիֆուգմամբ և SDS-PAGE գելի վերլուծությամբ, իսկ αS ֆրակցիան նոսր և խտացված փուլերում քանակականացվել է տարբեր LLPS լուծույթներում:100 μl LLPS նմուշ, որը պարունակում էր 1 μM AF488 պիտակավորված αS, պատրաստվել է մանրակրկիտ խառնմամբ, որին հաջորդել է ցենտրիֆուգումը 9600×g-ում 30 րոպե, որից հետո նստվածքը սովորաբար տեսանելի էր:Վերին նյութի 50 մկլ-ը օգտագործվել է սպիտակուցի քանակականացման համար՝ օգտագործելով SDS-PAGE գել:Գելերը սկանավորվել են AF488 ֆիլտրերով՝ օգտագործելով ChemiDoc գելային պատկերման համակարգը (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) կամ ներկվել են Coomassie ներկով և տեսողականացվել համապատասխան զտիչներով:Ստացված շերտերը վերլուծվել են ImageJ տարբերակ 1.53i-ի միջոցով (Առողջապահության ազգային ինստիտուտ, ԱՄՆ):Փորձերն իրականացվել են կրկնօրինակով երկու տարբեր փորձերի մեջ՝ նմանատիպ արդյունքներով:
Սովորաբար, 150 մկլ նմուշները կիրառվել են չկապող 96 հորատանցքերի միկրոսալերի վրա և տեսանելի են սենյակային ջերմաստիճանում Leica DMI6000B շրջված մանրադիտակի վրա (Leica Microsystems, Wetzlar, Գերմանիա):Կետային փորձերի համար օգտագործվել են նաև μ-Slide Angiogenesis թիթեղները (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Գերմանիա) կամ 96 հորանի պոլիստիրոլի միկրոսալիկներ (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts):Որպես լուսավորության աղբյուրներ օգտագործվել են EL6000 հալոգեն կամ սնդիկի մետաղի հալոգենային լամպեր (համապատասխանաբար BF/DIC և WF պատկերների համար):WF մանրադիտակի համար օգտագործվել է 40x խոշորացման օդային օբյեկտ (Leica Microsystems, Գերմանիա)՝ լույսը նմուշի վրա կենտրոնացնելու և այն հավաքելու համար:AF488 և ThT պիտակավորված նմուշների համար ֆիլտրի գրգռումը և արտանետումը ստանդարտ GFP ֆիլտրերի հավաքածուներով, գրգռման և արտանետման տիրույթի ֆիլտրերով, համապատասխանաբար, 460–500 նմ և 512–542 նմ տիրույթի ֆիլտրերով և 495 նմ երկխոսական հայելիով։Atto647N-ով պիտակավորված նմուշների համար օգտագործվել է Cy5 ֆիլտրերի ստանդարտ հավաքածու՝ գրգռման և արտանետման տիրույթի ֆիլտրերով 628–40 նմ և 692–40 նմ համապատասխանաբար, և 660 նմ երկխրոնիկ հայելի։BF և DIC մանրադիտակի համար օգտագործեք նույն արտացոլված լույսի հավաքման օբյեկտը:Հավաքված լույսը ձայնագրվել է Leica DFC7000 CCD տեսախցիկով (Leica Microsystems, Գերմանիա):Էքսպոզիցիոն ժամանակը 50 մվ էր BF և DIC մանրադիտակի պատկերման համար և 20-100 մվ WF մանրադիտակի պատկերման համար:Համեմատության համար նշենք, որ ThT-ով բոլոր փորձերի ազդեցության ժամանակը 100 ms էր:Կաթիլների միաձուլումը պատկերացնելու համար կատարվեցին ժամանակային փորձեր, որոնց պատկերները հավաքվում էին յուրաքանչյուր 100 ms-ում մի քանի րոպեի ընթացքում:Պատկերի վերլուծության համար օգտագործվել է ImageJ (NIH, ԱՄՆ):Փորձերն իրականացվել են եռակի՝ նմանատիպ արդյունքներով։
Համագոյացման փորձերի, FRAP-ի և 3D-ի վերակառուցման համար պատկերները ձեռք են բերվել Zeiss LSM 880 շրջված կոնֆոկալ մանրադիտակի վրա՝ օգտագործելով ZEN 2 կապույտ հրատարակությունը (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Գերմանիա):50 մկլ-ի նմուշները կիրառվել են μ-Slide Angiogenesis Petri սպասքի վրա (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Գերմանիա), մշակվել հիդրոֆիլ պոլիմերով (ibiTreat) և տեղադրվել 63× յուղի ընկղմման օբյեկտի մեջ (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) DIC-ի վրա):Պատկերները ստացվել են՝ օգտագործելով 458 նմ, 488 նմ և 633 նմ արգոն լազերային գծեր՝ 0,26 մկմ/պիքսել լուծաչափով և 8 մկվ/պիքսել ազդեցության ժամանակով՝ 470–600 նմ, 493–628 գրգռման և արտանետումների հայտնաբերման պատուհանների համար։ և 638–755 նմ օգտագործվել է համապատասխանաբար ThT, AF488 և Atto647N պատկերացման համար:FRAP-ի փորձերի համար յուրաքանչյուր նմուշի ժամանակային լուսանկարահանումը գրանցվել է վայրկյանում 1 կադր արագությամբ:Փորձերն իրականացվել են սենյակային ջերմաստիճանում եռակի անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով:Բոլոր պատկերները վերլուծվել են Zen 2 blue edition ծրագրի միջոցով (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Գերմանիա):FRAP կորերը նորմալացվել են, գծագրվել և տեղադրվել են ինտենսիվության/ժամանակի տվյալներին, որոնք արդյունահանվել են Zen 2-ի միջոցով OriginPro 9.1-ի օգտագործմամբ պատկերներից:Վերականգնման կորերը տեղադրվել են մոնոէքսպոնենցիալ մոդելի վրա՝ հաշվի առնելով մոլեկուլային դիֆուզիոն հավելյալ էքսպոնենցիալ տերմինով, որը հաշվի է առնում ձեռքբերման սպիտակեցման էֆեկտը:Այնուհետև մենք հաշվարկեցինք D-ն՝ օգտագործելով սպիտակեցման անվանական շառավիղը և նախկինում որոշված ​​վերականգնման կես կյանքը, ինչպես Kang et al-ի հավասարման մեջ:5 35 ցույց է տրված։
αS-ի մեկ ցիստեին տարբերակները սինթեզվել են 4-հիդրօքսի-2,2,6,6-տետրամեթիլպիպերիդին-N-օքսիլով (TEMPOL) 24 (TEMPOL-24-αS) և 122 (TEMPOL-122-αS) դիրքերում: համապատասխանաբար.Spin պիտակավորում EPR փորձերի համար αS-ի կոնցենտրացիան սահմանվել է 100 մկմ, իսկ PEG-ի կոնցենտրացիան՝ 15% (w/v):Տարբեր ագրեգացման պայմանների դեպքում αS:pLK հարաբերակցությունը 1:10 էր, մինչդեռ αS:ΔNt-Tau և αS:Tau441 հարաբերակցությունները պահպանվեցին 1:1:Խցանումների բացակայության դեպքում կապակցման տիտրման փորձերի համար TEMPOL-122-αS-ը պահպանվել է 50 մկմ-ում, իսկ պոլիկատիոնները տիտրվել են աճող կոնցենտրացիաներում՝ յուրաքանչյուր պայման պատրաստելով առանձին:CW-EPR չափումները կատարվել են Bruker ELEXSYS E580 X-band սպեկտրոմետրի միջոցով, որը հագեցած է Bruker ER4118 SPT-N1 ռեզոնատորով, որն աշխատում է ~9,7 ԳՀց միկրոալիքային (SHF) հաճախականությամբ:Ջերմաստիճանը սահմանվել է 25°C և վերահսկվում է հեղուկ ազոտի կրիոստատի միջոցով:Սպեկտրները ստացվել են չհագեցած պայմաններում 4 մՎտ հզորությամբ ՄՎտ հզորությամբ, 0,1 մՏ մոդուլյացիայի ամպլիտուդով և 100 կՀց մոդուլյացիայի հաճախականությամբ։Սպեկտրային ինտենսիվությունները նորմալացվել են՝ խուսափելու համար նմուշների միջև պտույտի կոնցենտրացիաների տարբերություններից և պտույտի հնարավոր նվազեցումից՝ Tau441 կամ ΔNt-Tau պարունակող նմուշներում (ներկա սպիտակուցի սկզբնական լուծույթներում) վերականգնող նյութերի մնացորդային կոնցենտրացիաների պատճառով:g-ի տրված արժեքները ստացվել են Matlab®67-ում ներդրված Easyspin ծրագրաշարի (v. 6.0.0-dev.34) միջոցով կատարված EPR սպեկտրային մոդելավորման արդյունքում:Տվյալների մոդելավորման համար օգտագործվել են մեկ/երկու բաղադրիչ իզոտրոպ մոդելներ:Բոլոր ազդանշանները նորմալացնելուց հետո մնացորդները հաշվարկվել են՝ յուրաքանչյուր սիմուլյացիա հանելով համապատասխան փորձարարական սպեկտրից:Պարտադիր տիտրման վերլուծության համար երրորդ գոտու հարաբերական ինտենսիվությունը նորմալացված EPR սպեկտրի երկրորդ գոտուն (IIII/III) օգտագործվել է αS-ին պոլիկատիոնների կապումը վերահսկելու համար:Դիսոցացիայի հաստատունը (Kd) գնահատելու համար ստացված կորը տեղադրվել է մոտավոր մոդելի վրա, որը ենթադրում է n նույնական և անկախ կապող վայրեր:
NMR սպեկտրոսկոպիայի փորձերն իրականացվել են Bruker Neo 800 ՄՀց (1H) NMR սպեկտրոմետրի միջոցով, որը հագեցած է կրիոպրոբիով և Z-գրադիենտով:Բոլոր փորձերն իրականացվել են 130–207 μM αS և համապատասխան αS/ΔNt-Tau և pLK համարժեքների միջոցով 10 մՄ HEPES, 100 մՄ NaCl, 10% DO, pH 7.4 և կատարվել են 15°C ջերմաստիճանում:LPS-ը NMR-ով վերահսկելու համար նախապես խառնված նմուշներին ավելացվել է 10% PEG:Քիմիական հերթափոխի շեղումների գծապատկերը (նկ. 1b) ցույց է տալիս միջին 1H և 15N քիմիական տեղաշարժերը:αS 2D1H-15N HSQC սպեկտրները նշանակվել են նախորդ հանձնարարության հիման վրա (BMRB մուտքագրում #25227) և հաստատվել՝ գրանցելով և վերլուծելով HNCA, HNCO և CBCAcoNH 3D սպեկտրները:13Cα և 13Cβ քիմիական տեղաշարժերը հաշվարկվել են ΔNt-Tau-ի կամ pLK-ի առկայության դեպքում՝ չափելու երկրորդական կառուցվածքի միտումների հնարավոր փոփոխությունները՝ համեմատած αS քիմիական տեղաշարժերի մաքուր պատահական կծիկի կառուցվածքում 68 (Լրացուցիչ նկար 5c):R1ρ արագությունները չափվել են hsqctretf3gpsi փորձերի ձայնագրմամբ (ստացված Bruker գրադարանից) 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 և 800 մվ ուշացումներով, և էքսպոնենցիալ ֆունկցիաները հարմարեցվել են գագաթնակետին տարբեր տարբերությամբ: անգամ R1ρ-ը և դրա փորձարարական անորոշությունը որոշելու համար:
Երկգույն ժամանակով լուծվող ֆլուորեսցենտային մանրադիտակի փորձեր են կատարվել առևտրային ժամանակով լուծվող MT200 ֆլուորեսցենտային կոնֆոկալ մանրադիտակի վրա (PicoQuant, Բեռլին, Գերմանիա)՝ ժամանակի փոխկապակցված մեկ ֆոտոնների հաշվման սարքով:Լազերային դիոդի գլուխը օգտագործվում է իմպուլսային միահյուսված գրգռման համար (PIE), ճառագայթն անցնում է մեկ ռեժիմով ալիքատարի միջով և կարգավորվում է 10-ից 100 նՎտ լազերային հզորությամբ 481 նմ և 637 նմ լազերային գծերի համար, որոնք չափվում են երկխրոնիկ հայելից հետո:Սա ապահովում է ֆոտոնների հաշվարկման օպտիմալ արագություն՝ խուսափելով ֆոտոնների այլասերման, ֆոտոսպիտակեցման և հագեցվածության հետևանքներից:μ-Սլայդ անգիոգենեզի ծածկոցները կամ թիթեղները (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Գերմանիա) ուղղակիորեն տեղադրվել են ընկղման ջրի մեջ Super Apochromat 60x NA 1.2 ոսպնյակի վրա՝ ուղղիչ մանյակով (Olympus Life Sciences, Waltham, ԱՄՆ):Որպես հիմնական ճառագայթի բաժանարար օգտագործվել է 488/640 նմ երկխրոնիկ հայելին (Semrock, Lake Forest, IL, ԱՄՆ):Չկենտրոնացված ճառագայթումը արգելափակվում է 50 մկմ տրամագծով անցքով, այնուհետև կենտրոնացված ճառագայթումը 50/50 ճառագայթի բաժանիչով բաժանվում է հայտնաբերման 2 ուղիների։Դետեկտորի դիմաց կիրառվել են շղթայական արտանետումների զտիչներ (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 կանաչ ներկի համար (AF488) և 690/70 կարմիր ներկի համար (Atto647N):Որպես դետեկտոր օգտագործվել են մեկ ֆոտոտոնային ավալանշ դիոդներ (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Իտալիա):Ինչպես տվյալների հավաքագրումը, այնպես էլ վերլուծությունը կատարվել են կոմերցիոն հասանելի SymphoTime64 ծրագրաշարի միջոցով (PicoQuant GmbH, Բեռլին, Գերմանիա):
LLPS-ի հիսուն միկրոլիտր նմուշներ կիրառվել են μ-Slide անգիոգենեզի հորերի վրա (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Գերմանիա):Ստացված պատկերները կենտրոնացված են հորատանցքի հատակից 20 մկմ՝ կախված կաթիլների համար օպտիմալ օբյեկտիվ աշխատանքային հեռավորության վրա և մինչև ~1 մկմ՝ լաստանավների և կետերի համար՝ առանցքային թույլատրելիությամբ առնվազն 0,25 մկմ/պիքսել և 400 մկմ/պիքսել հետաձգման ժամանակով:Ընտրեք տվյալները՝ կիրառելով ինտենսիվության շեմ՝ հիմնված ֆոնային ազդանշանի միջին ինտենսիվության վրա (PBG, միջին + 2σ) յուրաքանչյուր ալիքի համար, որպեսզի ընտրվեն միայն հեղուկ սպիտակուցի կաթիլները, լաստանավները կամ բծերը՝ զտելով ցրված փուլից ցանկացած հնարավոր ծագում:Յուրաքանչյուր ալիքի յուրաքանչյուր տեսակի (τ) կյանքի տեւողությունը վերլուծելու համար (կանաչ, «g» AF488-ի համար և կարմիր, «r»՝ Atto647N-ի համար), մենք ընտրեցինք հետաքրքրության շրջաններ (ROI), որոնք պարունակում են կաթիլներ, լաստանավներ կամ բծեր (Լրացուցիչ նկար 1): )8b) և ստացվել դրանք՝ հարմարեցնելով իրենց կյանքի ընթացքում քայքայվելը (τD, τR և τP կաթիլների, լաստանավերի կամ բծերի համար, համապատասխանաբար, տես Լրացուցիչ Նկար 8c) յուրաքանչյուր ալիքում՝ օգտագործելով պոչը համապատասխանող վերլուծություն և երկու բաղադրիչ քայքայման մոդել:Միջին τ-ից τ.ROI-ները, որոնք արտադրել են շատ քիչ ֆոտոններ՝ բազմաէքսպոնենցիալ համապատասխանության համար, բացառվել են վերլուծությունից:Օգտագործված կտրվածքը եղել է <104 ֆոտոն լաստանավների և կետերի համար և 103՝ կաթիլների համար:Կաթիլներն ունեն ավելի ցածր շեմ, քանի որ դժվար է ստանալ քայքայման կորեր ավելի բարձր ինտենսիվության արժեքներով, քանի որ պատկերի դաշտում կաթիլները սովորաբար ավելի փոքր են և քիչ թվով:ROI-ները, որոնց թիվը ֆոտոնների քանակով գերազանցում է ֆոտոնների կուտակման սահմանը (սահմանված է >500 հաշվում/պիքսել) նույնպես հեռացվել են վերլուծության համար:Համապատասխանեցրեք հետաքրքրության շրջանից ստացված ինտենսիվության քայքայման կորը առավելագույնի 90%-ի ինտենսիվությամբ (քայքայման առավելագույն ինտենսիվությունից մի փոքր հետո) ծառայության ժամկետի սկզբից՝ ապահովելու IRF նվազագույն միջամտությունը՝ պահպանելով նույնը բոլոր ինտենսիվության քայքայման համար: Պարամետրեր Հարաբերական ժամանակի պատուհանը Վերլուծվել է 25-ից 50 ROI լաստանավների և բծերի համար և 15-25 ROI՝ կաթիլների համար, պատկերներ ընտրվել են ավելի քան 4 կրկնություններից, որոնք գրանցված են առնվազն 3 անկախ փորձերից:Երկկողմանի t-թեստերը օգտագործվել են տեսակների կամ համակցված համակարգերի միջև վիճակագրական տարբերությունները գնահատելու համար:Կյանքի տևողության (τ) պիքսել առ պիքսել վերլուծության համար հաշվարկվել է դաշտի վրա կյանքի տևողության ընդհանուր թուլացումը յուրաքանչյուր ալիքի համար և կատարվել է 2/3 բաղադրիչ էքսպոնենցիալ թուլացման մոդելի մոտարկում:Յուրաքանչյուր պիքսելի կյանքի տևողության թուլացումը այնուհետև տեղադրվեց՝ օգտագործելով նախկինում հաշվարկված τ արժեքները, ինչը հանգեցրեց կեղծ գույնի FLIM համապատասխան պատկերին:Միևնույն ալիքի բոլոր պատկերներում պոչը տեղավորելու տիրույթը նույնն էր, և յուրաքանչյուր քայքայումն արտադրում էր բավականաչափ ֆոտոններ՝ հուսալի համապատասխանություն ապահովելու համար:FRET-ի վերլուծության համար պիքսելներն ընտրվել են՝ կիրառելով 100 ֆոտոնից ցածր ինտենսիվության շեմ, որը միջինում կազմում է 11 ֆոտոն ֆոնային ազդանշան (FBG):Յուրաքանչյուր ալիքի ֆլյուորեսցենտային ինտենսիվությունը շտկվել է փորձարարորեն որոշված ​​ուղղիչ գործակիցներով. 69 սպեկտրալ խաչաձև α-ն եղել է 0,004, ուղղակի գրգռման β-ը եղել է 0,0305, հայտնաբերման արդյունավետությունը γ՝ 0,517:FRET-ի արդյունավետությունը պիքսելային մակարդակում այնուհետև հաշվարկվում է հետևյալ հավասարման միջոցով.
որտեղ FDD-ն դոնորային (կանաչ) ալիքում դիտվող ֆլյուորեսցենտային ինտենսիվությունն է, FDA-ն անուղղակի գրգռման ներքո ընկալվող (կարմիր) ալիքում դիտվող ֆլուորեսցենտային ինտենսիվությունն է, իսկ FAA-ն ուղղակի գրգռման ներքո դիտվող ֆլուորեսցենտային (կարմիր) ալիքում ( կարկանդակ):Կապուղում նկատվում են լյումինեսցենցիայի ինտենսիվության իմպուլսներ):
Տեղադրեք 100 μl LLPS ռեակցիայի լուծույթներ, որոնք պարունակում են 25 μM չպիտակավորված մոնոմեր Tau441 (25 μM αS-ով կամ առանց դրա) LLPS բուֆերի մեջ (լրացվում է վերևում) չկպչող 96 հորատանցքի միկրոսալերի վրա՝ փայլաթիթեղի կպչուն ծածկույթով, և կաթիլների առաջացումը ստուգվել է WF միկրոսկոյով: հավասարակշռություն.10 րոպեի ընթացքում:Սենյակային ջերմաստիճանում 48 ժամ ինկուբացիայից հետո հաստատվել է սպիտակուցային լաստանավների և բծերի առկայությունը:Այնուհետև զգուշորեն հեռացրեք հեղուկը լաստանավների վրայից հորերից, այնուհետև ավելացրեք 50 լ դիսոցման բուֆեր (10 մՄ HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 մՄ DTT) և ինկուբացրեք 10 րոպե:Աղի բարձր կոնցենտրացիան ապահովում է, որ LLPS-ը չի կրկնվի մնացորդային PEG-ի պատճառով, և հնարավոր սպիտակուցային հավաքները, որոնք ձևավորվել են միայն էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությունների արդյունքում, կքանդվեն:Հորատի հատակն այնուհետև զգուշորեն քերել են միկրոպիպետտի ծայրով և ստացված լուծույթը տեղափոխել դատարկ դիտահոր:50 μM ThT-ով նմուշների 1 ժամ ինկուբացիայից հետո մեկուսացված բծերի առկայությունը ստուգվել է WF մանրադիտակով:Պատրաստեք հնչյունավորված αS մանրաթելեր՝ 7 օր ինկուբացնելով 70 μM αS լուծույթը PBS-ում՝ pH 7,4, նատրիումի ազիդ 0,01% 37 °C-ում և 200 rpm 7 օր օրբիտալ թափահարողի վրա:Այնուհետև լուծույթը ցենտրիֆուգվել է 9600×g-ում 30 րոպե, գնդիկը կրկին կասեցվել է PBS pH 7.4-ով և ֆիբրիլային նմուշներ (1 րոպե, 50% ցիկլ, 80% ամպլիտուդություն Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, ԱՄՆ) ֆիբրիլային նմուշներում: փոքր մանրաթելերի չափերի համեմատաբար միատեսակ բաշխմամբ:
FCS/FCCS վերլուծությունը և երկու գույնի համընկնման հայտնաբերումը (TCCD) իրականացվել են նույն MT200 ժամանակի լուծվող ֆլուորեսցենտային կոնֆոկալ մանրադիտակի վրա (Pico-Quant, Բեռլին, Գերմանիա), որն օգտագործվում էր FLIM-FRET միկրոսկոպիայի փորձերի համար՝ օգտագործելով PIE ռեժիմը:Այս փորձերի համար լազերային հզորությունը ավելացվել է մինչև 6,0 µW (481 նմ) և 6,2 մՎտ (637 նմ):Այս լազերային հզորությունների համակցությունն ընտրվել է նմանատիպ պայծառություն արտադրելու համար օգտագործվող ֆտորոֆորների զույգերի համար՝ միաժամանակ հասնելով օպտիմալ հաշվառման արագության և խուսափելով ֆոտոսպիտակեցումից և հագեցվածությունից:Ինչպես տվյալների հավաքագրումը, այնպես էլ վերլուծությունը կատարվել են կոմերցիոն հասանելի SymphoTime64 տարբերակի 2.3 ծրագրաշարի միջոցով (PicoQuant, Բեռլին, Գերմանիա):
LLPS-ի միջոցով ստացված մեկուսացված αS/Tau ագրեգատների նմուշները նոսրացվում են մեկուսացման բուֆերում՝ մինչև համապատասխան մոնոմոլեկուլային կոնցենտրացիան (սովորաբար 1:500 նոսրացում, քանի որ ագրեգատներն արդեն ցածր կոնցենտրացիաներում են, երբ մեկուսացված են կոացերվատ նմուշներից):Նմուշները ուղղակիորեն կիրառվել են ծածկոցների վրա (Կորնինգ, ԱՄՆ)՝ նախապես պատված BSA լուծույթով 1 մգ/մլ կոնցենտրացիայով:
Կանաչ և կարմիր ալիքներում PIE-smFRET վերլուծության համար կիրառվել է 25 ֆոտոնից ցածր ինտենսիվության շեմ՝ մոնոմերային իրադարձությունների հետևանքով առաջացած ցածր ինտենսիվության ազդանշանները զտելու համար (նկատի ունեցեք, որ մոնոմերները գերազանցում են ագրեգացված նմուշներին՝ համեմատած մեկուսացված ագրեգատների հետ):Այս շեմը հաշվարկվել է որպես մոնոմեր αS-ի հնգապատիկ միջին ինտենսիվությունը, որը ստացվել է մաքուր մոնոմերի նմուշների վերլուծությունից՝ վերլուծության համար հատուկ ագրեգատներ ընտրելու համար:PIE սկավառակի սխեման, TSCPC տվյալների հավաքագրման հետ միասին, հնարավորություն է տվել կիրառել ողջ կյանքի ընթացքում կշռող ֆիլտր, որն օգնում է վերացնել ֆոնային և սպեկտրալ խաչմերուկը:Վերոնշյալ շեմերի օգտագործմամբ ընտրված բռնկման ինտենսիվությունը շտկվել է՝ օգտագործելով միջին ֆոնային ազդանշանը, որը որոշվել է առաջացման հիստոգրամներից՝ ընդդեմ միայն բուֆերային նմուշների ինտենսիվության/աղբի:Խոշոր ագրեգատների հետ կապված պայթյունները սովորաբար զբաղեցնում են մի քանի անընդմեջ աղբարկղեր ժամանակի հետագծի մեջ (սահմանված է 1 ms):Այս դեպքերում ընտրվել է առավելագույն ամրության աղբարկղ:FRET և stoichiometric վերլուծության համար օգտագործվել է տեսականորեն որոշված ​​γ գամմա գործակիցը (0,517):Սպեկտրային խտրականության և ուղղակի գրգռման ներդրումը աննշան է (որոշվում է փորձնականորեն) օգտագործվող գրգռման լազերային հզորության դեպքում:Պայթյունում FRET-ի արդյունավետությունը և ստոիքիոմետրիան հաշվարկվում է հետևյալ կերպ.