Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար:Դուք օգտագործում եք զննարկչի տարբերակ՝ CSS-ի սահմանափակ աջակցությամբ:Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել Համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում):Բացի այդ, շարունակական աջակցություն ապահովելու համար մենք կայքը ցուցադրում ենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Սլայդերներ, որոնք ցույց են տալիս երեք հոդված յուրաքանչյուր սլայդում:Օգտագործեք հետևի և հաջորդ կոճակները՝ սլայդների միջով շարժվելու համար, կամ սլայդ կարգավորիչի կոճակները վերջում՝ յուրաքանչյուր սլայդով շարժվելու համար:
Ապրանքի մանրամասն նկարագրություն
304 Չժանգոտվող պողպատից եռակցված փաթաթված խողովակ /խողովակ
1. Տեխնիկական: Չժանգոտվող պողպատից կծիկ խողովակ / խողովակ
2. Տեսակը` եռակցված կամ անխափան
3. Ստանդարտ՝ ASTM A269, ASTM A249
4. Չժանգոտվող պողպատից կծիկ խողովակ OD՝ 6 մմ-ից 25.4 մմ
5. Երկարությունը՝ 600-3500 մմ կամ ըստ հաճախորդի պահանջի:
6. Պատի հաստությունը՝ 0,2 մմ-ից 2,0 մմ:
7. Հանդուրժողականություն՝ OD՝ +/-0.01 մմ;Հաստությունը՝ +/-0,01%.
8. Կծիկի ներքին անցքի չափը՝ 500MM-1500MM (կարելի է ճշգրտվել՝ ըստ հաճախորդի պահանջների)
9. Կծիկի բարձրությունը՝ 200MM-400MM (կարելի է ճշգրտվել ըստ հաճախորդի պահանջների)
10. Մակերեւույթ՝ պայծառ կամ եռացված
11. Նյութը՝ 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, խառնուրդ 625, 825, 2205, 2507 և այլն։
12. Փաթեթավորում՝ հյուսված պայուսակներ փայտե պատյանով, փայտե ծղոտե ներքնակով, փայտե լիսեռով կամ ըստ հաճախորդի պահանջի
13. Փորձարկում. քիմիական բաղադրիչ, զիջման ուժ, առաձգական ուժ, կարծրության չափում
14. Երաշխիք՝ երրորդ կողմի (օրինակ՝ SGS TV ) ստուգում և այլն։
15. Կիրառում՝ դեկորացիա, կահույք, նավթի փոխադրում, ջերմափոխանակիչ, բազրիքների պատրաստում, թղթի պատրաստում, ավտոմոբիլային, սննդի վերամշակում, բժշկական և այլն։
Չժանգոտվող պողպատի բոլոր քիմիական բաղադրությունը և ֆիզիկական հատկությունները, ինչպես ստորև.
| Նյութ | ASTM A269 Քիմիական բաղադրություն % Max | ||||||||||
| C | Mn | P | S | Si | Cr | Ni | Mo | ՆԲ | Nb | Ti | |
| TP304 | 0,08 | 2.00 | 0,045 | 0,030 | 1.00 | 18.0-20.0 | 8,0-11,0 | ^ | ^ | ^ . | ^ |
| TP304L | 0,035 | 2.00 | 0,045 | 0,030 | 1.00 | 18.0-20.0 | 8.0-12.0 | ^ | ^ | ^ | ^ |
| TP316 | 0,08 | 2.00 | 0,045 | 0,030 | 1.00 | 16.0-18.0 | 10.0-14.0 | 2.00-3.00 | ^ | ^ | ^ |
| TP316L | 0,035 Դ | 2.00 | 0,045 | 0,030 | 1.00 | 16.0-18.0 | 10.0-15.0 | 2.00-3.00 | ^ | ^ | ^ |
| TP321 | 0,08 | 2.00 | 0,045 | 0,030 | 1.00 | 17.0-19.0 | 9,0-12,0 | ^ | ^ | ^ | 5C -0,70 |
| TP347 | 0,08 | 2.00 | 0,045 | 0,030 | 1.00 | 17.0-19.0 | 9,0-12,0 | 10C -1.10 | ^ | ||
| Նյութ | Ջերմային բուժում | Ջերմաստիճանը F (C) Min. | Կարծրություն | |
| Բրինել | Ռոքվել | |||
| TP304 | Լուծում | 1900 (1040) | 192HBW/200HV | 90 HRB |
| TP304L | Լուծում | 1900 (1040) | 192HBW/200HV | 90 HRB |
| TP316 | Լուծում | 1900 (1040) | 192HBW/200HV | 90 HRB |
| TP316L | Լուծում | 1900 (1040) | 192HBW/200HV | 90 HRB |
| TP321 | Լուծում | 1900 (1040) Ֆ | 192HBW/200HV | 90 HRB |
| TP347 | Լուծում | 1900 (1040) | 192HBW/200HV | 90 HRB |
| OD, դյույմ | OD հանդուրժողականություն դյույմ (մմ) | WT հանդուրժողականություն % | Հանդուրժողականության երկարությունը դյույմ (մմ) | |
| + | - | |||
| ≤ 1/2 | ± 0,005 (0,13) | ± 15 | 1/8 (3.2) | 0 |
| > 1/2 ~ 1 1/2 | ± 0,005 (0,13) | ± 10 | 1/8 (3.2) | 0 |
| > 1 1 / 2 ~< 3 1 / 2 | ± 0,010 (0,25) | ± 10 | 3 / 16 (4.8) | 0 |
| > 3 1 / 2 ~< 5 1 / 2 | ± 0,015 (0,38) | ± 10 | 3 / 16 (4.8) | 0 |
| > 5 1/2 ~< 8 | ± 0,030 (0,76) | ± 10 | 3 / 16 (4.8) | 0 |
| 8~< 12 | ± 0,040 (1,01) | ± 10 | 3 / 16 (4.8) | 0 |
| 12~< 14 | ± 0,050 (1,26) | ± 10 | 3 / 16 (4.8) | 0 |
Բնական մանրէաբանական համայնքները ֆիլոգենետիկ և մետաբոլիկ բազմազան են:Ի լրումն օրգանիզմների քիչ ուսումնասիրված խմբերի1, այս բազմազանությունը նաև հարուստ ներուժ ունի էկոլոգիապես և կենսատեխնոլոգիական նշանակություն ունեցող ֆերմենտների և կենսաքիմիական միացությունների հայտնաբերման համար2,3:Այնուամենայնիվ, այս բազմազանության ուսումնասիրությունը՝ որոշելու գենոմային ուղիները, որոնք սինթեզում են այդպիսի միացությունները և կապում դրանք իրենց համապատասխան հյուրընկալողներին, մնում է մարտահրավեր:Բաց օվկիանոսում միկրոօրգանիզմների կենսասինթետիկ ներուժը հիմնականում անհայտ է մնում գլոբալ մասշտաբով գենոմի ամբողջական լուծման տվյալների վերլուծության սահմանափակումների պատճառով:Այստեղ մենք ուսումնասիրում ենք օվկիանոսում բիոսինթետիկ գեների կլաստերների բազմազանությունն ու բազմազանությունը՝ ինտեգրելով մոտ 10,000 մանրէաբանական գենոմ՝ մշակված բջիջներից և առանձին բջիջներից, ավելի քան 25,000 նոր վերակառուցված գենոմների ավելի քան 1000 ծովի ջրի նմուշներից:Այս ջանքերը հայտնաբերել են մոտ 40,000 ենթադրյալ հիմնականում նոր կենսասինթետիկ գեների կլաստերներ, որոնցից մի քանիսը հայտնաբերվել են նախկինում չկասկածված ֆիլոգենետիկ խմբերում:Այս պոպուլյացիաներում մենք հայտնաբերել ենք բիոսինթետիկ գեների կլաստերներով («Candidatus Eudormicrobiaceae») հարստացված տոհմ, որը պատկանում էր չմշակված բակտերիաների խմբին և ներառում էր այս միջավայրում բիոսինթետիկորեն ամենատարբեր միկրոօրգանիզմներից մի քանիսը:Դրանցից մենք բնութագրել ենք ֆոսֆատազ-պեպտիդ և պիտոնամիդ ուղիները՝ համապատասխանաբար բացահայտելով կենսաակտիվ միացությունների անսովոր կառուցվածքի և ֆերմենտաբանության դեպքեր:Եզրափակելով, այս ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, թե ինչպես միկրոբիոմի վրա հիմնված ռազմավարությունները կարող են թույլ տալ նախկինում չնկարագրված ֆերմենտների և բնական մթերքների հետախուզումը վատ հասկացված միկրոբիոտայում և միջավայրում:
Մանրէները խթանում են գլոբալ կենսաերկրաքիմիական ցիկլերը, պահպանում են սննդային ցանցերը և առողջ են պահում բույսերն ու կենդանիները5:Նրանց հսկայական ֆիլոգենետիկ, մետաբոլիկ և ֆունկցիոնալ բազմազանությունը հարուստ ներուժ է ներկայացնում նոր տաքսոնների1, ֆերմենտների և կենսաքիմիական միացությունների, ներառյալ բնական արտադրանքների հայտնաբերման համար6:Էկոլոգիական համայնքներում այս մոլեկուլները միկրոօրգանիզմներին ապահովում են տարբեր ֆիզիոլոգիական և էկոլոգիական գործառույթներով՝ հաղորդակցությունից մինչև մրցակցություն 2, 7:Ի լրումն իրենց սկզբնական գործառույթների, այս բնական արտադրանքը և դրանց գենետիկորեն կոդավորված արտադրական ուղիները օրինակներ են տալիս կենսատեխնոլոգիական և թերապևտիկ կիրառությունների համար2,3:Նման ուղիների և կապերի բացահայտմանը մեծապես նպաստել է աճեցված մանրէների ուսումնասիրությունը:Այնուամենայնիվ, բնական միջավայրերի տաքսոնոմիկ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ միկրոօրգանիզմների ճնշող մեծամասնությունը մշակված չէ8:Այս մշակութային կողմնակալությունը սահմանափակում է բազմաթիվ մանրէների կողմից կոդավորված ֆունկցիոնալ բազմազանությունը շահագործելու մեր կարողությունը4,9:
Այս սահմանափակումները հաղթահարելու համար վերջին տասնամյակի ընթացքում տեխնոլոգիական առաջընթացը թույլ է տվել հետազոտողներին ուղղակիորեն (այսինքն՝ առանց նախնական կուլտուրայի) հաջորդականացնել մանրէաբանական ԴՆԹ-ի բեկորները ամբողջ համայնքներից (մետագենոմիկա) կամ առանձին բջիջներից:Այս բեկորները գենոմի ավելի մեծ բեկորների մեջ հավաքելու և համապատասխանաբար բազմաթիվ մետագենոմիկ հավաքված գենոմներ (MAG) կամ մեկ ուժեղացված գենոմներ (SAGs) վերակառուցելու ունակությունը կարևոր հնարավորություն է բացում միկրոբիոմի (այսինքն՝ մանրէաբանական համայնքների և միկրոբիոմի) տաքսոցենտրիկ ուսումնասիրությունների համար:նոր ուղիներ հարթել.սեփական գենետիկ նյութը տվյալ միջավայրում) 10,11,12.Իրոք, վերջին ուսումնասիրությունները մեծապես ընդլայնել են Երկրի վրա մանրէների բազմազանության ֆիլոգենետիկ ներկայացումը1, 13 և բացահայտել են ֆունկցիոնալ բազմազանության մեծ մասը առանձին մանրէաբանական համայնքներում, որոնք նախկինում ընդգրկված չեն եղել մշակված միկրոօրգանիզմների գենոմի հղումների հաջորդականությամբ (REFs)14:Չբացահայտված ֆունկցիոնալ բազմազանությունը հյուրընկալող գենոմի համատեքստում (այսինքն՝ գենոմի լուծույթը) տեղադրելու կարողությունը կարևոր է դեռևս չբնութագրված մանրէաբանական գծերը կանխատեսելու համար, որոնք ենթադրաբար կոդավորում են նոր բնական արտադրանք15,16 կամ նման միացությունները հետագծելու համար մինչև իրենց սկզբնական արտադրողը17:Օրինակ, մետագենոմիկ և միաբջիջ գենոմային վերլուծության համակցված մոտեցումը հանգեցրել է Candidatus Entotheonella-ի՝ նյութափոխանակության առումով հարուստ սպունգի հետ կապված բակտերիաների խմբի նույնականացմանը, որպես տարբեր դեղամիջոցների պոտենցիալ արտադրողների18:Այնուամենայնիվ, չնայած տարատեսակ մանրէաբանական համայնքների գենոմային հետազոտության վերջին փորձերին,16,19 Երկրի էկոհամակարգերի ամենամեծ օվկիանոսի գլոբալ մետագենոմիկ տվյալների ավելի քան երկու երրորդը դեռևս բացակայում է16,20:Այսպիսով, ընդհանուր առմամբ, ծովային միկրոբիոմի բիոսինթետիկ ներուժը և նրա ներուժը որպես նոր ֆերմենտային և բնական արտադրանքների պահոց մնում են հիմնականում չուսումնասիրված:
Ծովային միկրոբիոմների կենսասինթետիկ ներուժը գլոբալ մասշտաբով ուսումնասիրելու համար մենք նախ միավորեցինք ծովային մանրէաբանական գենոմները, որոնք ստացվել են մշակույթից կախված և ոչ մշակութային մեթոդներով, որպեսզի ստեղծենք ֆիլոգենետիկայի և գենային ֆունկցիայի ընդարձակ տվյալների բազա:Այս տվյալների բազայի ուսումնասիրությունը բացահայտեց կենսասինթետիկ գեների կլաստերների (BGCs) լայն տեսականի, որոնց մեծ մասը պատկանում է դեռևս չբնութագրված գենային կլաստերների (GCF) ընտանիքներին:Բացի այդ, մենք հայտնաբերել ենք անհայտ բակտերիաների ընտանիք, որը մինչ օրս բաց օվկիանոսում ցուցադրում է BGC-ների ամենաբարձր հայտնի բազմազանությունը:Մենք ընտրեցինք երկու ռիբոսոմային սինթեզի և հետթարգմանական ձևափոխված պեպտիդների (RiPP) ուղիներ փորձարարական վավերացման համար՝ հիմնվելով ներկայումս հայտնի ուղիներից դրանց գենետիկական տարբերությունների վրա:Այս ուղիների ֆունկցիոնալ բնութագրումը բացահայտեց ֆերմենտաբանության անսպասելի օրինակներ, ինչպես նաև պրոթեզերոնի արգելակող ակտիվությամբ կառուցվածքային անսովոր միացություններ:
Սկզբում մենք նպատակ ունեինք ստեղծել գենոմի վերլուծության գլոբալ տվյալների ռեսուրս՝ կենտրոնանալով դրա բակտերիալ և արխեային բաղադրիչների վրա:Այդ նպատակով մենք հավաքեցինք մետագենոմիական տվյալներ և 1038 ծովի ջրի նմուշներ 215 գլոբալ բաշխված նմուշառման վայրերից (լայնության միջակայք = 141,6°) և մի քանի խորը շերտերից (1-ից մինչև 5600 մ խորության վրա՝ ընդգրկելով պելագիկ, մեզոպելագիկ և անդունդային գոտիները):Նախապատմություն21,22,23 (նկ. 1ա, ընդլայնված տվյալներ, նկ. 1ա և լրացուցիչ աղյուսակ 1):Ի հավելումն լայն աշխարհագրական ծածկույթի, այս ընտրովի ֆիլտրացված նմուշները մեզ թույլ տվեցին համեմատել ծովային միկրոբիոմի տարբեր բաղադրիչներ, այդ թվում՝ վիրուսներով հարուստ (<0,2 մկմ), պրոկարիոտներով հարուստ (0,2–3 մկմ), մասնիկներով հարուստ (0,8 մկմ)։ )–20 մկմ) և վիրուսով սպառված (>0,2 մկմ) գաղութներ:
ա, Ծովային մանրէաբանական համայնքների հանրությանը հասանելի 1038 գենոմներ (մետագենոմիկա) հավաքվել են 215 գլոբալ բաշխված վայրերից (62°S-ից մինչև 79°N և 179°W-ից մինչև 179°E .):Քարտեզի սալիկներ © Esri.Աղբյուրներ՝ GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ և Esri:բ, այս մետագենոմներն օգտագործվել են MAG-ների (մեթոդներ և լրացուցիչ տեղեկություններ) վերակառուցման համար, որոնք տարբերվում են քանակով և որակով (մեթոդներ) տվյալների հավաքածուներում (նշված գույնով):Վերակառուցված MAG-ները համալրվել են հանրությանը հասանելի (արտաքին) գենոմներով, ներառյալ ձեռագործ MAG26, SAG27 և REF:27 Կազմել OMD.գ, համեմատած նախորդ զեկույցների հետ, որոնք հիմնված են միայն SAG (GORG)20-ի կամ MAG-ի (GEM)16-ի վրա, OMD-ն բարելավում է ծովային մանրէաբանական համայնքների գենոմային բնութագրումը (մետագենոմիկ ընթերցման քարտեզագրման արագություն, մեթոդ) երկու-երեք անգամ՝ ավելի հետևողական ներկայացմամբ խորությամբ և լայնություն..<0,2, n=151, 0,2-0,8, n=67, 0,2-3, n=180, 0,8-20, n=30, >0,2, n=610, <30°, n = 132, 30–60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28: դ, OMD խմբավորումը տեսակների կլաստերների մակարդակով (95% միջին նուկլեոտիդային նույնականացում) նույնացնում է ընդհանուր մոտավորապես 8300 տեսակ, որոնց կեսից ավելին նախկինում չի բնութագրվել ըստ GTDB-ի (տարբերակ 89) e-ի, ըստ տաքսոնոմիական ծանոթագրությունների, տեսակների դասակարգումն ըստ գենոմի տիպի ցույց է տվել, որ MAG, SAG և REF-ները լավ են լրացնում միմյանց՝ արտացոլելով ֆիլոգենետիկ բազմազանությունը։ ծովային միկրոբիոմը.Մասնավորապես, տեսակների 55%, 26% և 11% հատուկ են MAG-ին, SAG-ին և REF-ին:BATS, Բերմուդյան Ատլանտյան Ժամային Շարք;GEM, Երկրի միկրոբիոմի գենոմներ;GORG, համաշխարհային օվկիանոսի տեղեկատու գենոմ;HOT, Հավայան օվկիանոսի ժամանակային շարք:
Օգտագործելով այս տվյալների բազան, մենք վերակառուցեցինք ընդհանուր առմամբ 26293 MAG, հիմնականում բակտերիալ և արխեալային (Նկար 1b և ընդլայնված տվյալներ, Նկար 1b):Մենք ստեղծել ենք այս MAG-ները առանձին, այլ ոչ թե համախմբված մետագենոմիկ նմուշներից հավաքներից՝ կանխելու տարբեր վայրերից կամ ժամանակային կետերից (մեթոդներից) նմուշների միջև բնական հաջորդականության տատանումների փլուզումը:Բացի այդ, մենք խմբավորեցինք գենոմային բեկորները՝ հիմնվելով դրանց տարածվածության հարաբերակցության վրա մեծ թվով նմուշներում (58-ից մինչև 610 նմուշ՝ կախված հետազոտության մեթոդից):Մենք պարզեցինք, որ սա ժամանակատար, բայց կարևոր քայլ է24, որը բաց է թողնվել մի քանի լայնածավալ MAG16, 19, 25 վերակառուցման աշխատանքներում և զգալիորեն բարելավում է քանակությունը (միջինում 2,7 անգամ) և որակը (միջինում +20%): գենոմը.վերակառուցված է այստեղ ուսումնասիրված ծովային մետագենոմից (ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 2ա և լրացուցիչ տեղեկություններ):Ընդհանուր առմամբ, այս ջանքերը հանգեցրին ծովային մանրէաբանական MAG-ների 4,5 անգամ ավելացման (6 անգամ, եթե հաշվի առնվեն միայն բարձրորակ MAG-ները)՝ համեմատած այսօր առկա ամենաընդգրկուն MAG ռեսուրսի հետ16 (Մեթոդներ):Այս նորաստեղծ MAG հավաքածուն այնուհետև համակցվեց 830 ձեռքով ընտրված MAG26-ի, 5969 SAG27-ի և 1707 REF-ի հետ:Ծովային բակտերիաների և արխեայի քսանյոթ տեսակներ կազմել են 34799 գենոմների համակցված հավաքածու (նկ. 1b):
Այնուհետև մենք գնահատեցինք նորաստեղծ ռեսուրսը` բարելավելու նրա կարողությունը` ներկայացնելու ծովային մանրէաբանական համայնքները և գնահատելու գենոմի տարբեր տեսակների ինտեգրման ազդեցությունը:Միջին հաշվով մենք պարզեցինք, որ այն ընդգրկում է ծովային մետագենոմիական տվյալների մոտավորապես 40-60%-ը (Նկար 1գ), որը երկու-երեք անգամ գերազանցում է միայն MAG-ի նախորդ զեկույցների ծածկույթը և՛ խորության, և՛ լայնության ավելի սերիական 16 կամ SAG20:Բացի այդ, հաստատված հավաքածուներում տաքսոնոմիական բազմազանությունը համակարգված չափելու համար մենք նշում էինք բոլոր գենոմները՝ օգտագործելով Genome Taxonomy Database (GTDB) գործիքակազմը (մեթոդները) և օգտագործեցինք միջին գենոմի նուկլեոտիդային նույնականությունը՝ 95%:28՝ բացահայտելու 8304 տեսակի կլաստերներ (տեսակներ):Այս տեսակների երկու երրորդը (ներառյալ նոր կլադերները) նախկինում չեն հայտնվել GTDB-ում, որոնցից 2790-ը հայտնաբերվել են այս հետազոտության մեջ վերակառուցված MAG-ի միջոցով (նկ. 1դ):Բացի այդ, մենք պարզեցինք, որ տարբեր տեսակի գենոմները խիստ փոխլրացնող են. տեսակների 55%, 26% և 11% կազմված են համապատասխանաբար ամբողջությամբ MAG-ից, SAG-ից և REF-ից (նկ. 1e):Ի լրումն, MAG-ն ընդգրկում էր ջրի սյունակում հայտնաբերված բոլոր 49 տեսակները, մինչդեռ SAG-ը և REF-ը ներկայացնում էին դրանցից միայն 18-ը և 11-ը, համապատասխանաբար:Այնուամենայնիվ, SAG-ն ավելի լավ է ներկայացնում ամենատարածված կլադների բազմազանությունը (ընդլայնված տվյալներ, Նկար 3ա), ինչպիսին է Pelagic Bacteriales (SAR11), որտեղ SAG-ն ընդգրկում է գրեթե 1300 տեսակ, իսկ MAG-ը՝ ընդամենը 390 տեսակ:Հատկանշական է, որ REF-ները հազվադեպ էին համընկնում MAG-ների կամ SAG-ների հետ տեսակների մակարդակում և ներկայացնում էին այստեղ ուսումնասիրված բաց օվկիանոսի մետագենոմիկ հավաքածուներում չգտնված մոտ 1000 գենոմների >95%-ը, հիմնականում՝ պայմանավորված այլ տեսակի մեկուսացված ներկայացուցչական ծովային նմուշների հետ փոխազդեցությամբ (օրինակ՝ նստվածքներ): .կամ հյուրընկալող-գործակից):Գիտական հանրությանը լայնորեն հասանելի դարձնելու համար ծովային գենոմի այս ռեսուրսը, որը ներառում է նաև չդասակարգված բեկորներ (օրինակ՝ կանխատեսված ֆագերից, գենոմային կղզիներից և գենոմի բեկորներից, որոնց համար բավարար տվյալներ չկան MAG-ի վերակառուցման համար), կարելի է համեմատել տաքսոնոմիկ տվյալների հետ։ .Օվկիանոսի մանրէաբանության տվյալների բազայում (OMD; https://microbiomics.io/ocean/) մուտք գործեք ծանոթագրություններ՝ գեների ֆունկցիայի և համատեքստային պարամետրերի հետ մեկտեղ:
Այնուհետև մենք ձեռնամուխ եղանք բացահայտելու բիոսինթետիկ ներուժի հարստությունն ու նորությունը բաց օվկիանոսի միկրոբիոմներում:Այդ նպատակով մենք նախ օգտագործեցինք antiSMASH բոլոր MAG-ների, SAG-ների և REF-ների համար, որոնք հայտնաբերվել են 1038 ծովային մետագենոմներում (մեթոդներում)՝ ընդհանուր 39,055 BGC-ների կանխատեսման համար:Այնուհետև մենք դրանք խմբավորեցինք 6907 ոչ ավելորդ GCF-ների և 151 գենային կլաստերների պոպուլյացիաների (GCCs; Լրացուցիչ Աղյուսակ 2 և մեթոդներ)՝ հաշվի առնելով բնորոշ ավելորդությունը (այսինքն՝ նույն BGC-ն կարող է կոդավորվել բազմաթիվ գենոմներում) և կենտրոնացված BGC-ների մետագենոմիկ տվյալների մասնատումը:Թերի BGC-ները էապես չեն ավելացել, եթե այդպիսիք կան (Լրացուցիչ տեղեկություններ), GCF-ների և GCC-ների թիվը համապատասխանաբար, որոնք պարունակում են առնվազն մեկ անձեռնմխելի BGC անդամ դեպքերի 44% և 86% դեպքերում:
GCC մակարդակում մենք գտանք կանխատեսված RiPP-ների և այլ բնական արտադրանքների լայն տեսականի (նկ. 2ա):Դրանց թվում, օրինակ, արիլպոլիենները, կարոտինոիդները, էկտոինները և սիդերոֆորները պատկանում են GCC-ներին, որոնք ունեն լայն ֆիլոգենետիկ բաշխում և օվկիանոսային մետագենոմների մեծ առատություն, ինչը կարող է ցույց տալ միկրոօրգանիզմների լայն հարմարվողականությունը ծովային միջավայրին, ներառյալ ռեակտիվ թթվածնի տեսակների նկատմամբ դիմադրությունը: օքսիդատիվ և օսմոտիկ սթրես:.կամ երկաթի կլանումը (լրացուցիչ տեղեկություններ):Այս ֆունկցիոնալ բազմազանությունը հակասում է NCBI RefSeq տվյալների բազայում (BiG-FAM/RefSeq, այսուհետ՝ RefSeq)29 պահվող մոտ 1,2 միլիոն BGC-ների վերջին վերլուծությանը՝ մոտ 190,000 գենոմների միջև, որը ցույց է տվել, որ ոչ ռիբոսոմային սինթետազային RPS պեպտիդներ (PKS) BGCs (Լրացուցիչ տեղեկություններ):Մենք նաև գտել ենք 44 (29%) GCC միայն հեռավորորեն կապված որևէ RefSeq BGC-ի հետ (\(\bar{d}\)RefSeq > 0.4; Նկար 2ա և մեթոդներ) և 53 (35%) GCC միայն MAG-ում, ընդգծելով պոտենցիալը: OMD-ում նախկինում չնկարագրված քիմիական նյութեր հայտնաբերելու համար:Հաշվի առնելով, որ այս GCC-ներից յուրաքանչյուրը, հավանաբար, ներկայացնում է բիոսինթետիկ շատ բազմազան գործառույթներ, մենք հետագայում վերլուծեցինք տվյալները GCF մակարդակում՝ փորձելով ապահովել BGC-ների ավելի մանրամասն խմբավորում, որոնք կանխատեսվում են կոդավորել նմանատիպ բնական արտադրանքների համար29:Ընդամենը 3861 (56%) նույնացված GCF-ները չեն համընկնում RefSeq-ի հետ, և GCF-ների >97%-ը բացակայում է MIBiG-ում՝ փորձարարորեն վավերացված BGC-ների ամենամեծ տվյալների բազաներից մեկում (Նկար 2b):Թեև զարմանալի չէ բազմաթիվ պոտենցիալ նոր ուղիների հայտնաբերումը այնպիսի միջավայրերում, որոնք լավ չեն ներկայացված տեղեկատու գենոմով, BGC-ները GCF-ների մեջ նախքան համեմատականը վերարտադրելու մեր մեթոդը տարբերվում է նախորդ զեկույցներից 16 և թույլ է տալիս մեզ տրամադրել նորության անաչառ գնահատական:Նոր բազմազանության մեծ մասը (3012 GCF կամ 78%) համապատասխանում է կանխատեսված տերպեններին, RiPP-ին կամ այլ բնական արտադրանքներին, և մեծ մասը (1815 GCF կամ 47%) կոդավորված է անհայտ տիպերով՝ շնորհիվ իրենց կենսասինթետիկ ներուժի:Ի տարբերություն PKS և NRPS կլաստերների, այս կոմպակտ BGC-ները ավելի քիչ հավանական է մասնատվելու մետագենոմային հավաքման ժամանակ 31 և թույլ են տալիս ավելի շատ ժամանակ և ռեսուրսներ պահանջող ֆունկցիոնալ բնութագրում իրենց արտադրանքի համար:
Ընդհանուր առմամբ 39,055 BGC-ները խմբավորվել են 6,907 GCF-ների և 151 GCC-ների:ա, տվյալների ներկայացում (ներքին արտաքին):BGC հեռավորությունների հիերարխիկ կլաստերավորում՝ հիմնված GCC-ի վրա, որոնցից 53-ը ամրագրված են միայն MAG-ի կողմից:GCC-ն պարունակում է BGC-ներ տարբեր տաքսոններից (ln-փոխակերպված դարպասի հաճախականություն) և տարբեր BGC դասերից (շրջանի չափը համապատասխանում է դրա հաճախականությանը):Յուրաքանչյուր GCC-ի համար արտաքին շերտը ներկայացնում է BGC-ների քանակը, տարածվածությունը (նմուշների տոկոսը) և հեռավորությունը (BGC կոսինուսի նվազագույն հեռավորությունը (min(dMIBiG))) BiG-FAM-ից մինչև BGC:GCC-ները BGC-ներով, որոնք սերտորեն կապված են փորձնականորեն հաստատված BGC-ների (MIBiG) հետ, ընդգծված են սլաքներով:բ Համեմատելով GCF-ը կանխատեսված (BiG-FAM) և փորձարարական վավերացված (MIBiG) BGC-ների հետ՝ հայտնաբերվել է 3861 նոր (d–>0.2) GCF:Այս ծածկագրերի մեծ մասը (78%) RiPP-ի, տերպենների և այլ ենթադրյալ բնական արտադրանքների համար:գ, 1038 ծովային մետագենոմներում հայտնաբերված OMD-ի բոլոր գենոմները տեղադրվել են GTDB բազային ծառում՝ ցույց տալու համար OMD-ի ֆիլոգենետիկ ծածկույթը:OMD-ում առանց որևէ գենոմի կլադերները ցուցադրվում են մոխրագույնով:BGC-ների թիվը համապատասխանում է կանխատեսված BGC-ների ամենամեծ թվին մեկ գենոմում տվյալ կլադի մեջ:Պարզության համար հանգույցների վերջին 15%-ը փլուզված է:Սլաքները ցույց են տալիս BGC-ով հարուստ կլադեր (>15 BGC), բացառությամբ Mycobacterium-ի, Gordonia-ի (երկրորդը միայն Rhodococcus-ից հետո) և Crocosphaera-ի (երկրորդը միայն Synechococcus-ից հետո):դ, Անհայտ գ.Էրեմիոբակտերոտան ցույց է տվել ամենաբարձր կենսասինթետիկ բազմազանությունը (Շանոնի ինդեքսը՝ հիմնված բնական արտադրանքի տեսակի վրա):Յուրաքանչյուր գոտի ներկայացնում է գենոմը, որն ունի այս տեսակի մեջ ամենաշատ BGC-ները:T1PKS, PKS տիպ I, T2/3PKS, PKS տիպ II և տիպ III:
Բացի հարստությունից և նորությունից, մենք ուսումնասիրում ենք ծովային միկրոբիոմի կենսասինթետիկ ներուժի կենսաաշխարհագրական կառուցվածքը:Նմուշների խմբավորումն ըստ միջին մետագենոմիկ GCF պատճենների թվի բաշխման (Մեթոդներ) ցույց է տվել, որ ցածր լայնության, մակերեսային, պրոկարիոտներով հարուստ և վիրուսներով աղքատ համայնքները, հիմնականում մակերեսային կամ ավելի խորը արևի լույսով ջրերից, հարուստ են RiPP և BGC տերպեններով:Ի հակադրություն, բևեռային, խոր ծովում, վիրուսներով և մասնիկներով հարուստ համայնքները կապված էին NRPS-ի և PKS BGC-ի ավելի մեծ առատության հետ (ընդլայնված տվյալներ, Նկար 4 և լրացուցիչ տեղեկություններ):Վերջապես, մենք գտանք, որ լավ ուսումնասիրված արևադարձային և պելագիկ համայնքները նոր տերպենների ամենահեռանկարային աղբյուրներն են (Augmented Data Figure):Ամենաբարձր ներուժը PKS-ի, RiPP-ի և այլ բնական արտադրանքների համար (Նկար 5ա՝ ընդլայնված տվյալներով):
Ծովային միկրոբիոմների կենսասինթետիկ ներուժի մեր ուսումնասիրությունը լրացնելու համար մենք նպատակ դրեցինք քարտեզագրել դրանց ֆիլոգենետիկ բաշխումը և բացահայտել BGC-ով հարստացված նոր կլադերները:Այդ նպատակով մենք ծովային մանրէների գենոմները տեղադրեցինք նորմալացված GTDB13 բակտերիալ և արխեալ ֆիլոգենետիկ ծառի մեջ և ծածկեցինք ենթադրյալ կենսասինթետիկ ուղիները, որոնք նրանք կոդավորում են (նկ. 2c):Մենք հեշտությամբ հայտնաբերել ենք BGC-ով հարստացված մի քանի կլադեր (ներկայացված են ավելի քան 15 BGC-ներով) ծովի ջրի նմուշներում (մեթոդներում), որոնք հայտնի են իրենց կենսասինթետիկ ներուժով, ինչպիսիք են ցիանոբակտերիաները (Synechococcus) և Proteus բակտերիաները, ինչպիսիք են Tistrella32,33, կամ վերջերս ուշադրություն են գրավել դրանց համար: բնական արտադրանք.ինչպիսիք են Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus և Planctomycetota34,35,36:Հետաքրքիր է, որ մենք գտանք մի քանի նախկինում չուսումնասիրված տոհմեր այս կլադներում:Օրինակ, Planctomycetota-ի և Myxococcota-ի ամենահարուստ կենսասինթետիկ պոտենցիալ ունեցող տեսակները համապատասխանաբար պատկանում էին չբնութագրված թեկնածուների և սեռերի (Լրացուցիչ Աղյուսակ 3):Ընդհանուր առմամբ, սա ենթադրում է, որ OMD-ն ապահովում է նախկինում անհայտ ֆիլոգենետիկ տեղեկատվության, ներառյալ միկրոօրգանիզմների հասանելիությունը, որոնք կարող են նոր թիրախներ ներկայացնել ֆերմենտների և բնական արտադրանքի հայտնաբերման համար:
Այնուհետև մենք բնութագրեցինք BGC-ով հարստացված կլադը՝ ոչ միայն հաշվելով դրա անդամների կողմից կոդավորված BGC-ների առավելագույն քանակը, այլև գնահատելով այս BGC-ների բազմազանությունը, ինչը բացատրում է բնական թեկնածուների տարբեր տեսակների հաճախականությունը (նկ. 2c և մեթոդներ ).Մենք պարզեցինք, որ այս հետազոտության մեջ բիոսինթետիկորեն ամենաբազմազան տեսակները ներկայացված էին հատուկ մշակված բակտերիալ MAG-ներով:Այս բակտերիաները պատկանում են Candidatus Eremiobacterota չմշակված ցեղատեսակին, որը մեծ մասամբ մնում է չուսումնասիրված մի քանի գենոմային հետազոտություններից բացի37,38:Հատկանշական է, որ «մոտ.Eremiobacterota սեռը վերլուծվել է միայն ցամաքային միջավայրում39 և հայտնի չէ, որ ներառում է BGC-ով հարստացված որևէ անդամ:Այստեղ մենք վերակառուցել ենք նույն տեսակի ութ ՄԱԳ (նուկլեոտիդային նույնականացում > 99%) 23: Ուստի մենք առաջարկում ենք տեսակի անվանումը «Candidatus Eudoremicrobium malaspinii», որը կոչվում է ներեիդ (ծովային նիմֆա) անունով, որը գեղեցիկ նվեր է հունական դիցաբանության և արշավախմբերի մեջ:― Կա։Համաձայն ֆիլոգենետիկ անոտացիայի 13-ի, E. malaspinii-ն նախկինում հայտնի հարազատներ չունի հաջորդականության մակարդակից ցածր և, հետևաբար, պատկանում է նոր բակտերիաների ընտանիքին, որը մենք առաջարկում ենք «Ca.E. malaspinii» որպես տիպի տեսակ և «Ca.Eudormicrobiaceae» որպես պաշտոնական անվանում (Լրացուցիչ տեղեկություններ):«Ca.E. malaspinii գենոմի նախագիծը վավերացվել է շատ ցածր մուտքագրման, երկար ընթերցված մետագենոմային հաջորդականության և մեկ նմուշի նպատակային հավաքման միջոցով (Մեթոդներ) որպես մեկ 9.63 Մբ գծային քրոմոսոմ՝ 75 կբ կրկնօրինակմամբ:որպես միակ մնացած երկիմաստությունը։
Այս տեսակի ֆիլոգենետիկ համատեքստը հաստատելու համար մենք փնտրեցինք 40 սերտորեն կապված տեսակներ Տարա օվկիանոսի արշավախմբի էուկարիոտներով հարստացված մետագենոմիկ լրացուցիչ նմուշներում՝ նպատակային գենոմի վերակառուցման միջոցով:Հակիրճ, մենք մետագենոմիական ընթերցումները կապել ենք գենոմային բեկորների հետ, որոնք կապված են «Ca.E. malaspinii» և ենթադրել, որ այս ընտրանքում հավաքագրման աճը ցույց է տալիս այլ հարազատների (մեթոդների) առկայությունը:Արդյունքում մենք գտանք 10 MAG-ներ՝ 19 MAG-ի համադրություն, որոնք ներկայացնում են հինգ տեսակներ երեք ցեղերի մեջ նոր սահմանված ընտանիքի ներսում (այսինքն՝ «Ca. Eudormicrobiaceae»):Ձեռքով ստուգումից և որակի վերահսկումից հետո (ընդլայնված տվյալներ, Նկար 6 և լրացուցիչ տեղեկություններ), մենք պարզեցինք, որ «Ca.Eudormicrobiaceae տեսակները ներկայացնում են ավելի մեծ գենոմներ (8 Մբ) և ավելի հարուստ կենսասինթետիկ ներուժ (14-ից 22 BGC յուրաքանչյուր տեսակի համար), քան մյուս «Ca» անդամները:Clade Eremiobacerota (մինչև 7 BGC) (նկ. 3a–c):
ա, հինգ «Ca.-ի ֆիլոգենետիկ դիրքերը.Eudormicrobiaceae-ի տեսակները ցույց են տվել BGC-ի հարստություն, որը հատուկ է այս ուսումնասիրության մեջ հայտնաբերված ծովային գծերին:Ֆիլոգենետիկ ծառը ներառում է բոլոր «Ca.MAG Eremiobacterota-ն և այլ ֆիլերի անդամները (գենոմի համարները փակագծերում) ներկայացված են GTDB-ում (տարբերակ 89) օգտագործվել են էվոլյուցիոն ֆոնի համար (Մեթոդներ):Ամենաարտաքին շերտերը ներկայացնում են դասակարգումներ ընտանիքի մակարդակով («Ca. Eudormicrobiaceae» և «Ca. Xenobiaceae») և դասակարգային մակարդակով («Ca. Eremiobacteria»):Այս հետազոտության մեջ նկարագրված հինգ տեսակները ներկայացված են այբբենական կոդերով և առաջարկվող երկանուն անուններով (Լրացուցիչ տեղեկություններ):բ, լավ.Eudormicrobiaceae տեսակները ունեն յոթ ընդհանուր BGC միջուկներ:BGC-ի բացակայությունը A2 կլադում պայմանավորված էր ներկայացուցչական MAG-ի ոչ լրիվությամբ (Լրացուցիչ Աղյուսակ 3):BGC-ները հատուկ են «Ca.Amphithomicrobium» և «Ca.Ամֆիթոմիկրոբիում» (կլադեր A և B) ցուցադրված չեն:գ, բոլոր BGC-ները կոդավորված են որպես «Ca.Պարզվել է, որ Eudoremicrobium taraoceanii-ն արտահայտված է Տարայի օվկիանոսներից վերցված 623 մետատրանսկրիպտոմներում:Պինդ շրջանակները ցույց են տալիս ակտիվ տառադարձում:Նարնջագույն շրջանագծերը նշանակում են log2-ով փոխակերպված ծալովի փոփոխությունները տնային տնտեսության գեների արտահայտման արագության (մեթոդների) ներքև և վերևում:դ, հարաբերական առատության կորեր (մեթոդներ), որոնք ցույց են տալիս «Ca.Eudormicrobiaceae-ի տեսակները տարածված են օվկիանոսային ավազանների մեծ մասում և ամբողջ ջրային սյունակում (մակերևույթից մինչև առնվազն 4000 մ խորություն):Այս գնահատականների հիման վրա մենք գտանք, որ «Ca.E. malaspinii'-ն կազմում է պրոկարիոտային բջիջների մինչև 6%-ը խորջրյա պելագիկ հացահատիկի հետ կապված համայնքներում:Մենք համարում էինք, որ տեսակը ներկա է տեղանքում, եթե այն գտնվել է տվյալ խորության շերտի չափի որևէ մասում:IO – Հնդկական օվկիանոս, NAO – Հյուսիսային Ատլանտյան, NPO – Հյուսիսային Խաղաղ օվկիանոս, RS – Կարմիր ծով, SAO – Հարավային Ատլանտյան, SO – Հարավային օվկիանոս, SPO – Հարավային Խաղաղ օվկիանոս:
Ca-ի առատության և բաշխման ուսումնասիրություն.Eudormicrobiaceae, որը, ինչպես պարզեցինք, գերակշռում է օվկիանոսային ավազանների մեծ մասում, ինչպես նաև ամբողջ ջրային սյունակում (նկ. 3d):Տեղական մակարդակում նրանք կազմում են ծովային մանրէաբանական համայնքի 6%-ը, ինչը նրանց դարձնում է համաշխարհային ծովային միկրոբիոմի կարևոր մասը:Բացի այդ, մենք գտանք Ca-ի հարաբերական բովանդակությունը։Eudormicrobiaceae տեսակները և դրանց BGC արտահայտման մակարդակները ամենաբարձրն էին էուկարիոտներով հարստացված ֆրակցիայում (նկ. 3c և ընդլայնված տվյալներ, Նկար 7), ինչը ցույց է տալիս հնարավոր փոխազդեցությունը մասնիկների, ներառյալ պլանկտոնի հետ:Այս դիտարկումը որոշակի նմանություն ունի «Ca.Eudoremicrobium BGC-ները, որոնք արտադրում են ցիտոտոքսիկ բնական արտադրանք հայտնի ուղիներով, կարող են դրսևորել գիշատիչ վարքագիծ (Լրացուցիչ տեղեկություններ և ընդլայնված տվյալներ, Նկար 8), նման այլ գիշատիչների, որոնք հատուկ արտադրում են մետաբոլիտներ, ինչպիսիք են Myxococcus41-ը:Ca-ի հայտնաբերում.Eudormicrobiaceae-ն ավելի քիչ հասանելի (օվկիանոսի խորը) կամ էուկարիոտիկ, քան պրոկարիոտ նմուշներում կարող է բացատրել, թե ինչու են այս բակտերիաները և դրանց անսպասելի BGC բազմազանությունը մնում անհասկանալի բնական սննդի հետազոտության համատեքստում:
Ի վերջո, մենք փորձեցինք հաստատել միկրոբիոմի վրա հիմնված մեր աշխատանքի խոստումը նոր ուղիներ, ֆերմենտներ և բնական արտադրանք հայտնաբերելու հարցում:BGC-ների տարբեր դասերի շարքում RiPP ուղին հայտնի է, որ կոդավորում է հարուստ քիմիական և ֆունկցիոնալ բազմազանություն՝ պայմանավորված հասուն ֆերմենտների կողմից հիմնական պեպտիդի տարբեր հետթարգմանական փոփոխություններով42:Այսպիսով, մենք ընտրեցինք երկու «Ca.Eudoremicrobium' RiPP BGC-ները (Նկարներ 3b և 4a-e) հիմնված են նույնի վրա, ինչ ցանկացած հայտնի BGC (\(\bar{d}\)MIBiG և \(\bar{d}\)RefSeq 0.2 վերևում):
a–c, In vitro հետերոլոգիական արտահայտություն և in vitro ֆերմենտային փորձարկումներ նոր (\(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) կլաստերի RiPP կենսասինթեզի, որը հատուկ է խորը ծովի Ca տեսակների համար:E. malaspinii'-ն հանգեցրեց դիֆոսֆորիլացված արտադրանքի արտադրությանը:գ, փոփոխություններ, որոնք հայտնաբերված են բարձր լուծաչափով (HR) MS/MS (մասնատումը, որը նշված է b և y իոններով քիմիական կառուցվածքում) և NMR (ընդլայնված տվյալներ, Նկար 9):դ, այս ֆոսֆորիլացված պեպտիդը ցուցադրում է կաթնասունների նեյտրոֆիլ էլաստազի ցածր միկրոմոլային արգելակում, որը չի հայտնաբերվել հսկիչ պեպտիդում և ջրազրկող պեպտիդում (քիմիական հեռացում առաջացած ջրազրկում):Փորձը կրկնվել է երեք անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով։Օրինակ, սպիտակուցի կենսասինթեզի երկրորդ նորովի \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33 կլաստերի հետերոլոգ արտահայտությունը պարզում է չորս հասուն ֆերմենտների գործառույթը, որոնք փոփոխում են 46 ամինաթթուների հիմնական պեպտիդը:Մնացորդները ներկվում են ըստ HR-MS/MS կանխատեսված փոփոխության վայրի, իզոտոպային պիտակավորման և NMR վերլուծության (Լրացուցիչ տեղեկություններ):Կտրված գունավորումը ցույց է տալիս, որ փոփոխությունը տեղի է ունենում երկու մնացորդներից որևէ մեկում:Նկարը բազմաթիվ հետերոլոգ կառուցվածքների հավաքածու է, որը ցույց է տալիս բոլոր հասուն ֆերմենտների ակտիվությունը նույն միջուկի վրա:h, NMR տվյալների նկարազարդում ողնաշարային ամիդի N-մեթիլացման համար:Ամբողջական արդյունքները ներկայացված են նկ.10 ընդլայնված տվյալներով:i, հասուն FkbM սպիտակուցային կլաստերի ֆերմենտի ֆիլոգենետիկ դիրքը MIBiG 2.0 տվյալների բազայում հայտնաբերված բոլոր FkbM տիրույթների մեջ բացահայտում է այս ընտանիքի ֆերմենտը N-մեթիլտրանսֆերազային ակտիվությամբ (Լրացուցիչ տեղեկություններ):Ցուցադրված են BGC-ների (a, e), պրեկուրսորային պեպտիդային կառուցվածքների (b, f) և բնական արտադրանքի ենթադրյալ քիմիական կառուցվածքների (c, g) սխեմատիկ դիագրամները:
Առաջին RiPP ուղին (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) հայտնաբերվել է միայն խորջրյա տեսակների «Ca.E. malaspinii» և պեպտիդ-պրեկուրսորի կոդերը (նկ. 4ա, բ):Այս հասուն ֆերմենտի մեջ մենք հայտնաբերել ենք մեկ ֆունկցիոնալ տիրույթ՝ հոմոլոգ լանտիպեպտիդ սինթազայի ջրազրկման տիրույթին, որը սովորաբար կատալիզացնում է ֆոսֆորիլացումը և 43-ի հետագա հեռացումը (Լրացուցիչ տեղեկություններ):Հետևաբար, մենք կանխատեսում ենք, որ պրեկուրսոր պեպտիդի ձևափոխումը ներառում է նման երկաստիճան ջրազրկում:Այնուամենայնիվ, օգտագործելով տանդեմ զանգվածային սպեկտրոմետրիան (MS/MS) և միջուկային մագնիսական ռեզոնանսային սպեկտրոսկոպիան (NMR), մենք հայտնաբերեցինք պոլիֆոսֆորիլացված գծային պեպտիդ (նկ. 4c):Թեև անսպասելի էր, մենք գտանք մի քանի ապացույցներ, որոնք հաստատում են դրա վերջնական արտադրանքը. երկու տարբեր հետերոլոգ հյուրընկալողներ և ոչ ջրազրկում in vitro վերլուծություններում, հիմնական մնացորդների հայտնաբերում, որոնք մուտացիայի ենթարկված են հասուն ֆերմենտի կատալիտիկ ջրազրկման վայրում:բոլորը վերակառուցվել են «Ca»-ի կողմից։E. malaspinii գենոմը (ընդլայնված տվյալներ, նկ. 9 և լրացուցիչ տեղեկություններ) և, վերջապես, ֆոսֆորիլացված արտադրանքի կենսաբանական ակտիվությունը, բայց ոչ քիմիապես սինթեզված ջրազրկված ձևը (նկ. 4դ):Փաստորեն, մենք պարզեցինք, որ այն ցուցադրում է ցածր միկրոմոլային պրոթեզերոնի արգելակող ակտիվություն նեյտրոֆիլ էլաստազի նկատմամբ, որը համեմատելի է այլ հարակից բնական արտադրանքների հետ կոնցենտրացիայի տիրույթում (IC50 = 14,3 մկՄ) 44 , չնայած այն հանգամանքին, որ էկոլոգիական դերը դեռևս պարզաբանման ենթակա է:Այս արդյունքների հիման վրա մենք առաջարկում ենք ուղին անվանել «ֆոսֆեպտին»:
Երկրորդ դեպքը բարդ RiPP ուղի է, որը հատուկ է «Ca.Eudoremicrobium (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) սեռը կանխատեսվում էր, որ կոդավորում է բնական սպիտակուցային արտադրանքները (նկ. 4e):Այս ուղիներն առանձնահատուկ կենսատեխնոլոգիական հետաքրքրություն են ներկայացնում, քանի որ ակնկալվող խտությունը և անսովոր քիմիական փոփոխությունների բազմազանությունը, որոնք հաստատվել են համեմատաբար կարճ BGC-ներով կոդավորված ֆերմենտների կողմից45:Մենք պարզեցինք, որ այս սպիտակուցը տարբերվում է նախկինում բնութագրված սպիտակուցներից նրանով, որ նրան բացակայում է ինչպես պոլիկերամիդների հիմնական NX5N մոտիվը, այնպես էլ լանդորնամիդների լանթիոնինի հանգույցը 46:Տարածված հետերոլոգ արտահայտման օրինաչափությունների սահմանափակումները հաղթահարելու համար մենք դրանք օգտագործեցինք Microvirgula aerodenitrificans սովորական համակարգի հետ միասին՝ բնութագրելու չորս հասուն ուղու ֆերմենտները (մեթոդները):Օգտագործելով MS/MS-ի, իզոտոպային պիտակավորման և NMR-ի համակցությունը, մենք հայտնաբերեցինք այս հասուն ֆերմենտները պեպտիդի 46-ամինաթթու միջուկում (նկ. 4f,g, ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 10–12 և լրացուցիչ տեղեկություններ):Հասուն ֆերմենտների թվում մենք բնութագրեցինք FkbM O-methyltransferase ընտանիքի անդամի 47 առաջին հայտնվելը RiPP ուղու վրա և անսպասելիորեն պարզեցինք, որ այս հասուն ֆերմենտը ներկայացնում է ողնաշարի N-մեթիլացում (նկ. 4h, i և լրացուցիչ տեղեկություններ):Թեև այս փոփոխությունը հայտնի է բնական NRP48 արտադրանքներում, ամիդային կապերի ֆերմենտային N-մեթիլացումը բարդ, բայց բիոտեխնոլոգիապես նշանակալի ռեակցիա49 է, որը մինչ այժմ հետաքրքրություն է ներկայացնում RiPP բորոզինների ընտանիքի համար:Կոնկրետություն 50,51.Այս ակտիվության նույնականացումը ֆերմենտների և RiPP-ի այլ ընտանիքներում կարող է բացել նոր կիրառություններ և ընդլայնել սպիտակուցների ֆունկցիոնալ բազմազանությունը 52 և դրանց քիմիական բազմազանությունը:Ելնելով հայտնաբերված փոփոխություններից և առաջարկվող արտադրանքի կառուցվածքի անսովոր երկարությունից՝ մենք առաջարկում ենք «pythonamide» ուղու անվանումը:
Ֆունկցիոնալ բնութագրվող ֆերմենտների ընտանիքում անսպասելի ֆերմենտաբանության հայտնաբերումը ցույց է տալիս շրջակա միջավայրի գենոմիկայի խոստումը նոր հայտնագործությունների համար, ինչպես նաև ցույց է տալիս ֆունկցիոնալ եզրակացությունների սահմանափակ կարողությունը, որը հիմնված է միայն հաջորդականության հոմոլոգիայի վրա:Այսպիսով, ոչ կանոնական կենսաակտիվ պոլիֆոսֆորիլացված RiPP-ների մասին զեկույցների հետ մեկտեղ մեր արդյունքները ցույց են տալիս ռեսուրսների ինտենսիվ, բայց կարևոր նշանակություն սինթետիկ կենսաբանության ջանքերի համար՝ լիովին բացահայտելու կենսաքիմիական միացությունների ֆունկցիոնալ հարստությունը, բազմազանությունը և անսովոր կառուցվածքը:
Այստեղ մենք ցույց ենք տալիս մանրէների կողմից կոդավորված կենսասինթետիկ ներուժի շրջանակը և նրանց գենոմային ենթատեքստը համաշխարհային ծովային միկրոբիոմում՝ հեշտացնելով հետագա հետազոտությունները՝ արդյունքում ստացված ռեսուրսը հասանելի դարձնելով գիտական հանրությանը (https://microbiomics.io/ocean/):Մենք պարզեցինք, որ դրա ֆիլոգենետիկ և ֆունկցիոնալ նորույթների մեծ մասը կարելի է ձեռք բերել միայն MAG-ների և SAG-ների վերակառուցմամբ, հատկապես չօգտագործված մանրէաբանական համայնքներում, որոնք կարող են առաջնորդել ապագա կենսահետախուզման ջանքերը:Թեև մենք այստեղ կկենտրոնանանք «Ca.Eudormicrobiaceae»-ն՝ որպես հատկապես կենսասինթետիկորեն «տաղանդավոր» տոհմ, չբացահայտված միկրոբիոտայում կանխատեսված BGC-ներից շատերը, հավանաբար, կոդավորում են նախկինում չնկարագրված ֆերմենտներ, որոնք առաջացնում են միացություններ շրջակա միջավայրի և/կամ կենսատեխնոլոգիական նշանակալի գործողություններով:
Օվկիանոսների ավազաններում, խորը շերտերում և ժամանակի ընթացքում գլոբալ ծովային մանրէաբանական համայնքների ծածկույթը առավելագույնի հասցնելու համար ընդգրկվել են օվկիանոսագրական և ժամանակային շարքերի հիմնական օվկիանոսագրական և ժամանակային շարքերի ուսումնասիրությունների մետագենոմիական տվյալների հավաքածուները, որոնք ունեն հաջորդականության բավարար խորություն:Այս տվյալների հավաքածուները (Լրացուցիչ Աղյուսակ 1 և Նկար 1) ներառում են Տարայի օվկիանոսներում հավաքված նմուշների մետագենոմիկա (վիրուսային հարստացված, n=190; պրոկարիոտային հարստացված, n=180)12,22 և BioGEOTRACES արշավախումբը (n=480):Հավայան օվկիանոսային ժամանակային շարք (HOT, n = 68), Բերմուդա-Ատլանտյան ժամանակային շարքեր (BATS, n = 62)21 և Malaspina Expedition (n = 58)23:Բոլոր մետագենոմային հատվածների հաջորդականության ընթերցումները զտվել են որակի համար՝ օգտագործելով BBMap (v.38.71)՝ հեռացնելով ընթերցումների հաջորդականության ադապտերները, հեռացնելով որակի վերահսկման հաջորդականություններին գծագրված ընթերցումները (PhiX գենոմներ) և օգտագործելով trimq=14, maq=20-ը մերժում է ընթերցման վատ որակը, maxns = 0 և minlength = 45: Հետագա վերլուծությունները կատարվել են կամ միացվել են QC ընթերցումների հետ, եթե նշված է (bbmerge.sh minoverlap=16):QC-ի ընթերցումները նորմալացվել են (bbnorm.sh թիրախ = 40, մտքի խորություն = 0) նախքան կառուցվելը metaSPA-ների միջոցով (v.3.11.1 կամ v.3.12, եթե անհրաժեշտ է)53:Ստացված փայտամածների կոնտակտները (այսուհետ՝ փայտամածներ) վերջնականապես զտվել են ըստ երկարության (≥1 կբ):
1038 մետագենոմիկ նմուշները բաժանվել են խմբերի, և նմուշների յուրաքանչյուր խմբի համար բոլոր նմուշների մետագենոմիկ որակի վերահսկման ցուցանիշները համապատասխանեցվել են յուրաքանչյուր նմուշի փակագծերին առանձին, ինչի արդյունքում ստացվել է զույգ փակագծերով խմբերի հետևյալ թիվը. Tara Marine Viruses – հարստացված (190×190 ), Prokaryotes հարստացված (180×180), BioGEOTRACES, HOT and BATS (610×610) և Malaspina (58×58):Քարտեզագրումը կատարվել է Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54 միջոցով, որը թույլ է տալիս ընթերցումները համապատասխանեցնել երկրորդական կայքերին (օգտագործելով -a դրոշը):Հավասարեցումները զտվել են, որպեսզի ունենան առնվազն 45 հիմք, ունեն ≥97% նույնականություն և ≥80% ընթերցումներ:Ստացված BAM ֆայլերը մշակվել են՝ օգտագործելով jgi_summarize_bam_contig_depths սկրիպտը MetaBAT2 (v.2.12.1)55-ի համար՝ յուրաքանչյուր խմբի համար ներքին և միջընտրանքային ծածկույթ ապահովելու համար:Վերջապես, փակագծերը խմբավորվեցին զգայունությունը բարձրացնելու համար՝ առանձին-առանձին գործարկելով MetaBAT2-ը բոլոր նմուշների վրա –minContig 2000 և –maxEdges 500-ով: Մենք օգտագործում ենք MetaBAT2-ը համույթի բռնցքամարտիկի փոխարեն, քանի որ անկախ թեստերում այն ապացուցվել է, որ այն ամենաարդյունավետ բռնցքամարտիկն է:և 10-ից 50 անգամ ավելի արագ, քան մյուս սովորաբար օգտագործվող բռնցքամարտիկները57:Առատության հարաբերակցության ազդեցությունը ստուգելու համար մետագենոմիկայի պատահականորեն ընտրված ենթանմուշը (10-ը Tara Ocean-ի երկու տվյալների հավաքածուների համար, 10-ը BioGEOTRACES-ի համար, 5-ը յուրաքանչյուր ժամանակային շարքի համար և 5-ը Malaspina-ի համար) լրացուցիչ օգտագործեց միայն նմուշներ:Ներքին նմուշները խմբավորվում են ծածկույթի մասին տեղեկատվություն ստանալու համար:(Լրացուցիչ տեղեկություն).
Հետագա վերլուծության մեջ ներառվել են լրացուցիչ (արտաքին) գենոմներ, մասնավորապես՝ 830 ձեռքով ընտրված MAG՝ Tara Oceans26 տվյալների բազայի ենթաբազմությունից, 5287 SAG՝ GORG20 տվյալների բազայից և տվյալներ MAR տվյալների բազայից (MarDB v. 4) 1707 մեկուսացված REF-ներից և 682 SAGs) 27. MarDB տվյալների բազայի համար գենոմներն ընտրվում են հասանելի մետատվյալների հիման վրա, եթե նմուշի տեսակը համապատասխանում է հետևյալ կանոնավոր արտահայտությանը. «[S|s]single.?[C|c]ell|[C|c]culture| [I|i] մեկուսացված':
Յուրաքանչյուր մետագենոմիկ տարայի և արտաքին գենոմի որակը գնահատվել է CheckM-ի (v.1.0.13) և Anvi'o's Lineage Workflow-ի (v.5.5.0) 58,59-ի միջոցով:Եթե CheckM-ը կամ Anvi'o-ն հաղորդում են ≥50% ամբողջականություն/լրիվություն և ≤10% աղտոտվածություն/ավելորդություն, ապա պահպանեք մետագենոմիկ բջիջները և արտաքին գենոմները հետագա վերլուծության համար:Այնուհետև այս միավորները միավորվեցին միջին ամբողջականության (mcpl) և միջին աղտոտվածության (mctn) մեջ՝ դասակարգելու գենոմի որակը ըստ համայնքի չափանիշների60 հետևյալ կերպ. բարձր որակ՝ mcpl ≥ 90% և mctn ≤ 5%;լավ որակ՝ mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, միջին որակ՝ mcpl ≥ 50% և mctn ≤ 10%, արդար որակ՝ mcpl ≤ 90% կամ mctn ≥ 10%։Այնուհետև զտված գենոմները փոխկապակցվեցին որակական միավորների հետ (Q և Q') հետևյալ կերպ. Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (շտամների փոփոխականություն)/100 + 0,5 x log[N50]:(իրականացվել է dRep61-ում):
Տվյալների տարբեր աղբյուրների և գենոմի տեսակների (MAG, SAG և REF) համեմատական վերլուծություն թույլ տալու համար 34,799 գենոմներ հանվել են գենոմի նուկլեոտիդների միջին նույնականության (ANI) հիման վրա՝ օգտագործելով dRep (v.2.5.4):Կրկնում է)61՝ 95% ANI շեմերով28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0.95 -nc 0.2) և մեկ օրինակով մարկերային գեներով՝ օգտագործելով SpecI63, որն ապահովում է գենոմի կլաստերավորում տեսակների մակարդակում:Յուրաքանչյուր dRep կլաստերի համար ընտրվել է ներկայացուցչական գենոմ՝ ըստ վերը սահմանված առավելագույն որակի գնահատականի (Q'), որը համարվում էր տեսակի ներկայացուցիչ:
Քարտեզագրման արագությունը գնահատելու համար BWA (v.0.7.17-r1188, -a) օգտագործվել է մետագենոմիական ընթերցումների բոլոր 1038 հավաքածուները քարտեզագրելու համար OMD-ում պարունակվող 34799 գենոմներով:Որակի վերահսկվող ընթերցումները քարտեզագրվեցին միակողմանի ռեժիմով, և արդյունքում ստացված հավասարեցումները զտվեցին՝ պահպանելու համար միայն ≥45 bp երկարությամբ հավասարեցումները:և ինքնությունը ≥95%:Յուրաքանչյուր նմուշի ցուցադրման հարաբերակցությունը ֆիլտրումից հետո մնացած ընթերցումների տոկոսն է՝ բաժանված որակի վերահսկման ընթերցումների ընդհանուր թվի վրա:Օգտագործելով նույն մոտեցումը՝ 1038 մետագենոմներից յուրաքանչյուրը կրճատվել է մինչև 5 միլիոն ներդիր (ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 1c) և համապատասխանեցվել GORG SAG-ին OMD-ում և բոլոր GEM16-ում:GEM16 կատալոգում ծովի ջրից վերականգնված MAG-ների քանակը որոշվել է մետագենոմիկ աղբյուրների հիմնաբառերի հարցումներով՝ ընտրելով ծովի ջրի նմուշներ (օրինակ՝ ի տարբերություն ծովային նստվածքների):Մասնավորապես, մենք ընտրում ենք «ջրային»՝ որպես «էկոհամակարգի_կատեգորիա», «ծովային»՝ որպես «էկոհամակարգի_տիպ», իսկ «բնակավայրը» զտում ենք որպես «խորը օվկիանոս», «ծովային», «ծովային օվկիանոս», «պելագիկ ծովային», «ծովային ջուր», «Օվկիանոս», «Ծովի ջուր», «Մակերևութային ծովային ջուր», «Մակերևութային ծովային ջուր»:Սա հանգեցրեց 5903 MAG-ների (734 բարձր որակ) բաշխված 1823 OTU-ների վրա (դիտումներ այստեղ):
Պրոկարիոտային գենոմները տաքսոնոմիկ կերպով ծանոթագրվել են GTDB-Tk (v.1.0.2)64-ի միջոցով՝ լռելյայն պարամետրերով, որոնք ուղղված են GTDB r89 13-րդ տարբերակին: Anvi'o-ն օգտագործվել է էուկարիոտների գենոմները նույնականացնելու համար՝ հիմնված տիրույթի կանխատեսման և հետկանչի ≥50% և ավելորդության ≤%-ի վրա:Տեսակի տաքսոնոմիկ ծանոթագրությունը սահմանվում է որպես նրա ներկայացուցչական գենոմներից մեկը:Բացառությամբ էուկարիոտների (148 MAG), յուրաքանչյուր գենոմ սկզբում ֆունկցիոնալ կերպով նշվել է prokka-ի (v.1.14.5)65-ի միջոցով՝ անվանելով ամբողջական գեներ, սահմանելով «արխեա» կամ «բակտերիաներ» պարամետրերը ըստ անհրաժեշտության, ինչը նաև հաղորդվում է ոչ կոդավորող գեներ.և CRISPR շրջանները, ի թիվս այլ գենոմային հատկանիշների:Նշեք կանխատեսված գեները՝ նույնականացնելով ունիվերսալ մեկ օրինակով մարկեր գեները (uscMG)՝ օգտագործելով fetchMG (v.1.2)66, նշանակել ուղղագրական խմբեր և հարցումներ կատարել՝ օգտագործելով emapper (v.2.0.1)67՝ հիմնված eggNOG (v.5.0)68-ի վրա:KEGG տվյալների բազա (հրապարակված 2020 թվականի փետրվարի 10-ին) 69. Վերջին քայլն իրականացվել է սպիտակուցների համապատասխանեցմամբ KEGG տվյալների բազայի հետ՝ օգտագործելով DIAMOND (v.0.9.30)70 հարցումը և թեմայի ընդգրկումը ≥70%:Արդյունքները հետագայում զտվեցին՝ համաձայն NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline71-ի՝ հիմնված առավելագույն ակնկալվող բիթերի արագության ≥ 50% արագության վրա (հղումը ինքնին):Գենային հաջորդականությունները օգտագործվել են նաև որպես մուտքագրում՝ գենոմում BGC-ները նույնականացնելու համար՝ օգտագործելով antiSMASH (v.5.1.0)72՝ լռելյայն պարամետրերով և տարբեր կլաստերային պայթյուններով:Բոլոր գենոմներն ու անոտացիաները հավաքվել են OMD-ում՝ համացանցում հասանելի համատեքստային մետատվյալների հետ միասին (https://microbiomics.io/ocean/):
Նախկինում նկարագրված մեթոդների նման12,22 մենք օգտագործեցինք CD-HIT (v.4.8.1)՝ բակտերիալ և արխեալ գենոմներից ավելի քան 56,6 միլիոն սպիտակուցներ կոդավորող գեներ խմբավորելու համար OMD-ից 95% նույնական և ավելի կարճ գեների (90% ծածկույթ)73 մինչև >17,7 միլիոն գենային կլաստերներ:Ամենաերկար հաջորդականությունը ընտրվել է որպես յուրաքանչյուր գենային կլաստերի ներկայացուցչական գեն:Այնուհետև 1038 մետագենոմները համապատասխանեցվեցին >17,7 միլիոն BWA (-a) կլաստերի անդամներին, և արդյունքում ստացված BAM ֆայլերը զտվեցին՝ պահպանելու համար միայն ≥95% տոկոս նույնականությամբ և ≥45 բազային հավասարեցումներով:Երկարությամբ նորմալացված գեների առատությունը հաշվարկվել է սկզբում հաշվելով ներդիրները լավագույն եզակի հավասարեցումից, այնուհետև մշուշոտ քարտեզագրված ներդիրների համար՝ ավելացնելով կոտորակային թվեր համապատասխան թիրախային գեներին՝ իրենց եզակի ներդիրների քանակին համաչափ:
Ընդլայնված OMD-ի գենոմները («Ca. Eudormicrobiaceae»-ի լրացուցիչ MAG-ներով, տես ստորև) ավելացվել են mOTUs74 մետագենոմիական վերլուծության գործիքների տվյալների բազայում (v.2.5.1)՝ ստեղծելու ընդլայնված mOTU հղման տվյալների բազա:Տասը uscMG-ից պահպանվել են միայն վեց մեկ օրինակով գենոմներ (23528 գենոմներ):Տվյալների բազայի ընդլայնումը հանգեցրեց տեսակների մակարդակով 4494 լրացուցիչ կլաստերների:1038 մետագենոմներ վերլուծվել են՝ օգտագործելով լռելյայն mOTU պարամետրերը (v.2):644 mOTU կլաստերներում պարունակվող 989 գենոմներ (95% REF, 5% SAG և 99.9% պատկանում են MarDB-ին) չեն հայտնաբերվել mOTU պրոֆիլի կողմից:Սա արտացոլում է MarDB գենոմների ծովային մեկուսացման տարբեր լրացուցիչ աղբյուրներ (չհայտնաբերված գենոմների մեծ մասը կապված է նստվածքներից, ծովային հյուրընկալողներից և այլնից մեկուսացված օրգանիզմների հետ):Այս ուսումնասիրության մեջ բաց օվկիանոսային միջավայրի վրա կենտրոնանալը շարունակելու համար մենք դրանք բացառեցինք ներքևի վերլուծությունից, եթե դրանք չհայտնաբերվեին կամ ներառվեին այս հետազոտության մեջ ստեղծված ընդլայնված mOTU տվյալների բազայում:
Բոլոր BGC-ները MAG-ից, SAG-ից և REF-ից OMD-ում (տես վերևում) համակցվել են բոլոր մետագենոմիկ փայտամածներում հայտնաբերված BGC-ների հետ (antiSMASH v.5.0, լռելյայն պարամետրեր) և բնութագրվել օգտագործելով BiG-SLICE (v.1.1) (PFAM տիրույթ )75:Ելնելով այս հատկանիշներից՝ մենք հաշվարկել ենք բոլոր կոսինուսային հեռավորությունները BGC-ների միջև և խմբավորել դրանք (միջին կապերը) GCF և GCC՝ օգտագործելով համապատասխանաբար 0.2 և 0.8 հեռավորության շեմերը:Այս շեմերը նախկինում օգտագործված շեմերի հարմարեցումն են՝ օգտագործելով Էվկլիդեսյան հեռավորությունը75, կոսինուսային հեռավորության հետ միասին, ինչը մեղմացնում է սկզբնական BiG-SLICE կլաստերավորման ռազմավարության սխալը (Լրացուցիչ տեղեկատվություն):
Այնուհետև BGC-ները զտվել են, որպեսզի պահպանեն միայն ≥5 կբ կոդավորված փայտամածների վրա՝ նվազեցնելու մասնատման ռիսկը, ինչպես նախկինում նկարագրված է16 և բացառելու MarDB REF-ները և SAG-ները, որոնք չեն հայտնաբերվել 1038 մետագենոմներում (տես վերևում):Սա հանգեցրեց նրան, որ ընդհանուր առմամբ 39,055 BGC-ները կոդավորված են OMD գենոմով, և լրացուցիչ 14,106-ը նույնականացվել է մետագենոմիկ բեկորների վրա (այսինքն՝ չհամակցված MAG-ների մեջ):Այս «մետագենոմիկ» BGC-ներն օգտագործվել են տվյալների բազայում չգրանցված ծովային միկրոբիոմի կենսասինթեզի պոտենցիալի մասնաբաժինը գնահատելու համար (Լրացուցիչ տեղեկատվություն):Յուրաքանչյուր BGC ֆունկցիոնալորեն բնութագրվում էր ըստ կանխատեսող արտադրանքի տեսակների, որոնք սահմանված են Anti-SMASH կամ ավելի կոպիտ արտադրանքի կատեգորիաներով, որոնք սահմանված են BiG-SCAPE76-ում:Քանակականացման հարցում նմուշառման կողմնակալությունը կանխելու համար (GCC/GCF-ի տաքսոնոմիկ և ֆունկցիոնալ կազմը, GCF-ի և GCC-ի հեռավորությունը հղումային տվյալների բազաներին և GCF-ի մետագենոմիկ առատությունը)՝ յուրաքանչյուր տեսակի համար պահելով միայն ամենաերկար BGC-ն մեկ GCF-ի համար, 39,055 BGC-ները հետագայում կրկնօրինակվել են, արդյունքում ստացվել է ընդհանուր 17689 BGC:
GCC-ի և GCF-ի նորույթը գնահատվել է` հիմնվելով հաշվարկված տվյալների բազայի (RefSeq տվյալների բազա BiG-FAM-ում)29 և փորձարարական ստուգված (MIBIG 2.0)30 BGC-ի միջև հեռավորության վրա:17689 ներկայացուցչական BGC-ներից յուրաքանչյուրի համար մենք ընտրել ենք ամենափոքր կոսինուսային հեռավորությունը համապատասխան տվյալների բազայից:Այդ նվազագույն հեռավորությունները այնուհետև միջինացվում են (միջին) ըստ GCF-ի կամ GCC-ի, ըստ անհրաժեշտության:GCF-ը համարվում է նոր, եթե տվյալների բազայի հեռավորությունը 0,2-ից մեծ է, ինչը համապատասխանում է (միջին) GCF-ի և տեղեկանքի միջև իդեալական բաժանմանը:GCC-ի համար մենք ընտրում ենք 0.4-ը, որը երկու անգամ գերազանցում է GCF-ի սահմանած շեմը՝ հղումների հետ երկարաժամկետ կապը կողպելու համար:
BGC-ի մետագենոմիկ առատությունը գնահատվել է որպես նրա կենսասինթետիկ գեների միջին առատություն (ինչպես որոշվում է հակա-SMASH-ով)՝ հասանելի գենային մակարդակի պրոֆիլներից:Այնուհետև յուրաքանչյուր GCF-ի կամ GCC-ի մետագենոմիկ առատությունը հաշվարկվել է որպես ներկայացուցչական BGC-ների գումար (17689-ից):Այս առատության քարտեզները հետագայում նորմալացվեցին բջջային կազմի համար՝ օգտագործելով մեկ նմուշի mOTU հաշվարկը, որը նաև հաշվի էր առնում հաջորդականության ջանքերը (ընդլայնված տվյալներ, Նկար 1դ):GCF-ի կամ GCC-ի տարածվածությունը հաշվարկվել է որպես > 0 առատությամբ նմուշների տոկոս:
Նմուշների միջև էվկլիդյան հեռավորությունը հաշվարկվել է նորմալացված GCF պրոֆիլից:Այս հեռավորությունները կրճատվել են չափերով՝ օգտագործելով UMAP77-ը, և ստացված ներկառուցումները օգտագործվել են HDBSCAN78-ի միջոցով չվերահսկվող խտության վրա հիմնված կլաստերի համար:HDBSCAN-ի կողմից օգտագործվող կլաստերի համար (և հետևաբար՝ կլաստերների քանակը) օպտիմալ նվազագույն միավորները որոշվում են՝ առավելագույնի հասցնելով կլաստերի անդամակցության կուտակային հավանականությունը:Հայտնաբերված կլաստերները (և այս կլաստերների պատահական հավասարակշռված ենթանմուշը՝ շեղումների փոփոխական բազմաչափ վերլուծության ժամանակ կողմնակալությունը հաշվի առնելու համար (PERMANOVA)) փորձարկվել են էվկլիդեսյան չկրճատված հեռավորությունների նկատմամբ նշանակալիության համար՝ օգտագործելով PERMANOVA:Նմուշների գենոմի միջին չափը հաշվարկվել է՝ ելնելով mOTU-ի հարաբերական առատությունից և գենոմների անդամների գնահատված գենոմի չափից:Մասնավորապես, յուրաքանչյուր MOTU-ի գենոմի միջին չափը գնահատվել է որպես նրա անդամների գենոմի չափերի միջինը, որը ճշգրտվել է ամբողջականության համար (ֆիլտրումից հետո) (օրինակ, 75% ամբողջական գենոմը 3 Մբ երկարությամբ ունի 4 ճշգրտված չափ։ Մբ).≥70% ամբողջականությամբ միջին գենոմների համար:Այնուհետև յուրաքանչյուր նմուշի գենոմի միջին չափը հաշվարկվել է որպես mOTU գենոմի չափերի գումար՝ կշռված հարաբերական առատությամբ:
OMD-ում գենոմով կոդավորված BGC-ների զտված հավաքածուն ցուցադրվում է բակտերիալ և հնէական GTDB ծառերում (≥5 կբ-ի շրջանակներում, բացառությամբ REF-ի և SAG MarDB-ի, որոնք չեն հայտնաբերվել 1038 մետագենոմներում, տես վերևում) և դրանց կանխատեսված արտադրանքի կատեգորիաները՝ հիմնված ֆիլոգենետիկի վրա: գենոմի դիրքը (տես վերևում):Մենք նախ կրճատեցինք տվյալներն ըստ տեսակների՝ որպես ներկայացուցչական օգտագործելով գենոմը, որն ունի ամենաշատ BGC-ներն այդ տեսակի մեջ:Վիզուալիզացիայի համար ներկայացուցիչները հետագայում բաժանվեցին ծառերի խմբերի, և կրկին, յուրաքանչյուր բջիջների համար որպես ներկայացուցիչ ընտրվեց գենոմը, որը պարունակում էր ամենամեծ թվով BGCs:BGC-ով հարստացված տեսակները (առնվազն մեկ գենոմ՝ >15 BGC-ով) հետագա վերլուծության են ենթարկվել՝ հաշվարկելով Շանոնի բազմազանության ինդեքսը այդ BGC-ներում կոդավորված արտադրանքի տեսակների համար:Եթե բոլոր կանխատեսված արտադրանքի տեսակները նույնն են, ապա քիմիական հիբրիդները և այլ բարդ BGC-ները (ինչպես կանխատեսվում է anti-SMAH-ի կողմից) համարվում են, որ պատկանում են նույն արտադրանքի տիպին, անկախ կլաստերի մեջ դրանց հերթականությունից (օրինակ՝ սպիտակուց-բակտերիոցին և բակտերիոցին-պրոտեոպրոտեինի միաձուլում): մարմին):հիբրիդ):
Malaspina նմուշ MP1648-ից մնացած ԴՆԹ-ն (գնահատվում է 6 նգ), որը համապատասխանում է SAMN05421555 կենսաբանական նմուշին և համընկնում է Illumina SRR3962772 մետագենոմիկ ընթերցման հավաքածուին կարճ ընթերցման համար, մշակվել է PacBio հաջորդականացման արձանագրության համաձայն՝ գերցածր kBimplit-ի ներածումով, PacNA-ն օգտագործելու համար: հավաքածու (100-980-000) և SMRTbell Express 2.0 ձևանմուշների պատրաստման հավաքածու (100-938-900):Համառոտ, մնացած ԴՆԹ-ն կտրվեց, վերանորոգվեց և մաքրվեց (ProNex ուլունքներ)՝ օգտագործելով Covaris (g-TUBE, 52104):Մաքրված ԴՆԹ-ն այնուհետև ենթարկվում է գրադարանային պատրաստման, ուժեղացման, մաքրման (ProNex ուլունքներ) և չափի ընտրությանը (> 6 կբ, Կապույտ Պիփին) մինչև վերջնական մաքրման քայլը (ProNex ուլունքներ) և հաջորդականացում Sequel II հարթակում:
Առաջին երկուսի վերակառուցումը մոտ.MAG Eremiobacterota-ի համար մենք հայտնաբերել ենք վեց լրացուցիչ ANIs >99% (դրանք ներառված են Նկար 3-ում), որոնք սկզբում զտվել են աղտոտվածության գնահատականների հիման վրա (հետագայում ճանաչվել են որպես գեների կրկնօրինակումներ, տես ստորև):Մենք նաև գտանք «Ca» պիտակով սկուտեղ:Էրեմիոբակտերոտա» տարբեր հետազոտություններից23 և դրանք օգտագործեցինք մեր ուսումնասիրության ութ MAG-ի հետ որպես հղում 633 էուկարիոտներով հարստացված (>0,8 մկմ) նմուշներից մետագենոմիկ ընթերցումների համար՝ օգտագործելով BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, - դրոշակ՝ իջեցված նմուշների համար: քարտեզագրում (5 միլիոն ընթերցում):Հիմնվելով հարստացման հատուկ քարտեզների վրա (զտված 95% հավասարեցման նույնականությամբ և 80% ընթերցված ծածկույթով) հավաքման համար ընտրվել է 10 մետագենոմ (ակնկալվող ծածկույթ ≥5×) և լրացուցիչ 49 մետագենոմ (ակնկալվող ծածկույթ ≥1×)՝ բովանդակության հարաբերակցության համար:Օգտագործելով նույն պարամետրերը, ինչ վերևում, այս նմուշները տեղադրվեցին և ավելացվեցին 10 լրացուցիչ «Ca»:MAG Eremiobacerota-ն վերականգնվել է:Այս 16 MAG-ները (չհաշված արդեն տվյալների բազայում գտնվող երկուսը) գենոմների ընդհանուր թիվը ընդլայնված OMD-ում հասնում է 34,815-ի:MAG-ներին տրվում են տաքսոնոմիական աստիճաններ՝ ելնելով նրանց գենոմային նմանությունից և GTDB-ում դիրքից:18 MAG-ները հեռացվել են dRep-ի միջոցով 5 տեսակների (ներտեսակային ANI >99%) և 3 սեռերի (ներգեներային ANI 85% -ից 94%) նույն ընտանիքում79:Տեսակների ներկայացուցիչներն ընտրվել են ձեռքով` հիմնվելով ամբողջականության, աղտոտվածության և N50-ի վրա:Առաջարկվող անվանացանկը ներկայացված է Լրացուցիչ տեղեկատվության մեջ:
Գնահատեք «Ca.»-ի ամբողջականությունը և աղտոտվածությունը:MAG Eremiobacterota, մենք գնահատեցինք uscMG-ի առկայությունը, ինչպես նաև տոհմային և տիրույթին հատուկ մեկ օրինակով մարկերային գեների հավաքածուներ, որոնք օգտագործվում էին CheckM-ի և Anvi'o-ի կողմից:40 uscMG-ից 2 կրկնօրինակների նույնականացումը հաստատվել է ֆիլոգենետիկ վերակառուցման միջոցով (տես ստորև)՝ բացառելու հնարավոր աղտոտումը (սա համապատասխանում է 5%-ին՝ հիմնված այս 40 մարկեր գեների վրա):Լրացուցիչ ուսումնասիրություն հինգ ներկայացուցչական MAGs 'Ca.Այս վերակառուցված գենոմներում աղտոտիչների ցածր մակարդակը հաստատվել է Eremiobacterota տեսակների համար՝ օգտագործելով Anvi'o ինտերակտիվ միջերեսը՝ հիմնված առատության և հաջորդականության կազմի հարաբերակցության վրա (Լրացուցիչ տեղեկություններ)59:
Ֆիլոգենոմիկ վերլուծության համար մենք ընտրել ենք հինգ ներկայացուցչական MAG «Ca»:Eudormicrobiaceae», բոլոր տեսակները «Ca.Eremiobacteria-ի և այլ ֆիլերի (ներառյալ UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria և Planctomycetota) գենոմը հասանելի է GTDB-ից (r89)13:Այս բոլոր գենոմները ծանոթագրվել են, ինչպես նախկինում նկարագրված է մեկ օրինակով մարկեր գենի արդյունահանման և BGC անոտացիայի համար:GTDB գենոմները պահպանվել են վերը նշված ամբողջականության և աղտոտվածության չափանիշների համաձայն:Ֆիլոգենետիկ անալիզը կատարվել է Anvi'o Phylogenetics59 աշխատանքային հոսքի միջոցով:Ծառը կառուցվել է օգտագործելով IQTREE (v.2.0.3) (լռելյայն ընտրանքներ և -bb 1000)80 39 տանդեմ ռիբոսոմային սպիտակուցների հավասարեցման վրա, որոնք նույնականացվել են Anvi'o-ի կողմից (MUSCLE, v.3.8.1551)81:Նրա պաշտոնները կրճատվել են։գենոմի առնվազն 50%-ը ծածկելու համար82 և Planctomycecota-ն օգտագործվել է որպես GTDB ծառի տոպոլոգիայի վրա հիմնված դուրս խումբ:40 uscMG-ից բաղկացած մեկ ծառ կառուցվել է նույն գործիքներով և պարամետրերով:
Մենք օգտագործեցինք Traitar (v.1.1.2) լռելյայն պարամետրերով (ֆենոտիպ, նուկլեոտիդներից)83՝ ընդհանուր մանրէաբանական հատկությունները կանխատեսելու համար:Մենք ուսումնասիրեցինք պոտենցիալ գիշատիչ ապրելակերպը՝ հիմնված նախկինում մշակված գիշատիչ ինդեքսի վրա84, որը կախված է գենոմում սպիտակուցը կոդավորող գենի պարունակությունից:Մասնավորապես, մենք օգտագործում ենք DIAMOND-ը՝ գենոմի սպիտակուցները համեմատելու համար OrthoMCL տվյալների բազայի (v.4)85-ի հետ՝ օգտագործելով ընտրանքները –ավելի զգայուն –id 25 –query-cover 70 –subject-cover 70 –top 20 ԵՎ հաշվում ենք համապատասխան գեները: Մարկերային գեներ գիշատիչների և ոչ գիշատիչների համար:Ցուցանիշը գիշատիչ և ոչ գիշատիչ գծանշումների քանակի տարբերությունն է։Որպես լրացուցիչ հսկողություն՝ մենք նաև վերլուծել ենք «Ca» գենոմը։Entotheonella TSY118 գործոնը հիմնված է Ca-ի հետ իր կապի վրա:Eudoremicrobium (գենոմի մեծ չափս և կենսասինթետիկ ներուժ):Այնուհետև մենք փորձարկեցինք հնարավոր կապերը գիշատիչ և ոչ գիշատիչ մարկերային գեների և Ca-ի կենսասինթետիկ ներուժի միջև:Eudormicrobiaceae» և պարզել է, որ ոչ ավելի, քան մեկ գեն (ցանկացած տեսակի մարկեր գենից, այսինքն՝ գիշատիչ/ոչ գիշատիչ գենից) համընկնում է BGC-ի հետ, ինչը ենթադրում է, որ BGC-ն չի շփոթում գիշատիչ ազդանշանները:Խճճված կրկնօրինակների լրացուցիչ գենոմային ծանոթագրությունն իրականացվել է TXSSCAN-ի միջոցով (v.1.0.2)՝ հատուկ հետազոտելու սեկրեցիայի համակարգը, ցուպիկը և դրոշակները86:
Հինգ ներկայացուցչական «Ca» քարտեզագրվեցին՝ քարտեզագրելով 623 մետատրանսկրիպտոմներ Տարայի օվկիանոսների պրոկարիոտային և էուկարիոտային հարստացման ֆրակցիաներից22,40,87 (օգտագործելով BWA, v.0.7.17-r1188, -a դրոշը):Eudormicrobiaceae գենոմը.BAM ֆայլերը մշակվել են FeatureCounts (v.2.0.1)88-ով 80% ընթերցման ծածկույթից և 95% նույնականացման ֆիլտրումից հետո (ընտրանքների առկայությամբ Counts –հիմնական –O –fraction –t CDS,tRNA –F GTF –g ID –p ) Հաշվում է ներդիրների քանակը մեկ գենի համար:Ստեղծված քարտեզները նորմալացվել են գենի երկարության և մարկերի գենի առատության համար mOTU (երկարությամբ նորմալացված ներդիրների միջին քանակությունը ներդիրների քանակով գեների համար >0) և log-փոխակերպվել մինչև 22,74՝ յուրաքանչյուր գենի մակարդակի մեկ բջջի հարաբերական արտահայտությունը ստանալու համար, ինչը նաև բացատրում է. փոփոխականությունը նմուշից նմուշ հաջորդականության ընթացքում:Նման գործակիցները թույլ են տալիս համեմատական վերլուծություն իրականացնել՝ մեղմացնելով կազմի խնդիրները հարաբերական առատության տվյալների օգտագործման ժամանակ:Հետագա վերլուծության համար դիտարկվել են միայն 10 mOTU մարկերային գեներից > 5-ով նմուշներ, որոնք թույլ են տալիս հայտնաբերել գենոմի բավական մեծ մասը:
«Ca.»-ի նորմալացված տրանսկրիպտոմի պրոֆիլը:E. taraoceanii-ն ենթարկվել է չափումների կրճատման՝ օգտագործելով UMAP-ը, և արդյունքում ստացված ներկայացումն օգտագործվել է HDBSCAN-ի միջոցով չվերահսկվող կլաստերավորման համար (տես վերևում)՝ արտահայտման կարգավիճակը որոշելու համար:PERMANOVA-ն ստուգում է հայտնաբերված կլաստերների միջև եղած տարբերությունների նշանակությունը սկզբնական (ոչ կրճատված) հեռավորության վրա:Այս պայմանների միջև դիֆերենցիալ արտահայտությունը փորձարկվել է գենոմում (տես վերևում), և 201 KEGG ուղիներ են հայտնաբերվել 6 ֆունկցիոնալ խմբերում, մասնավորապես՝ BGC, սեկրեցիայի համակարգ և դրոշակակիր գեներ TXSSCAN-ից, դեգրադացիոն ֆերմենտներ (պրոտեազա և պեպտիդազներ) և գիշատիչ և ոչ գիշատիչ գեներ.գիշատիչ ինդեքսի մարկերներ.Յուրաքանչյուր նմուշի համար մենք հաշվարկել ենք միջինացված նորմալացված արտահայտությունը յուրաքանչյուր դասի համար (նկատի ունեցեք, որ BGC արտահայտությունն ինքնին հաշվարկվում է որպես այդ BGC-ի կենսասինթետիկ գեների միջին արտահայտություն) և փորձարկվել է կարևորության համար բոլոր պետություններում (Kruskal-Wallis թեստը ճշգրտված FDR-ի համար):
Սինթետիկ գեները գնվել են GenScript-ից, իսկ PCR պրայմերները՝ Microsynth-ից:Ֆյուզիոն պոլիմերազը Thermo Fisher Scientific-ից օգտագործվել է ԴՆԹ-ի ուժեղացման համար:ԴՆԹ-ի մաքրման համար օգտագործվել են NucleoSpin պլազմիդները, NucleoSpin գելը և Macherey-Nagel-ի PCR մաքրման հավաքածուն:Սահմանափակող ֆերմենտներ և T4 ԴՆԹ լիգազան ձեռք են բերվել New England Biolabs-ից:Իզոպրոպիլ-β-d-1-թիոգալակտոպիրանոզիդից (IPTG) (Biosynth) և 1,4-դիթիոթրեիտոլից (DTT, AppliChem) բացի այլ քիմիական նյութերը գնվել են Sigma-Aldrich-ից և օգտագործվել առանց հետագա մաքրման:Հակաբիոտիկները քլորամֆենիցիլ (Cm), սպեկտինոմիցին դիհիդրոքլորիդ (Sm), ամպիցիլին (Amp), գենտամիցին (Gt) և կարբենիցիլին (Cbn) գնվել են AppliChem-ից:Bacto Tryptone և Bacto Yeast Extract մեդիա բաղադրիչները ձեռք են բերվել BD Biosciences-ից:Տրիպսինը հաջորդականության համար գնվել է Promega-ից:
Գենային հաջորդականությունները հանվել են հակա-SMASH կանխատեսված BGC 75.1-ից:E. malaspinii (Լրացուցիչ տեղեկություններ):
embA (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5), embM (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4) գեները և embAM (ներառյալ pU միջգենային շրջանները) օպտիմիզացվել են առանց սինդրոմայի միջգենային շրջանների (ներառյալ գենային միջգենային շրջանները) սինխրոնիզացված: արտահայտվելու համար Ե երբ.EmbA գենը ենթակլոնավորվել է pACYCDuet-1(CmR) և pCDFDuet-1(SmR) առաջին բազմակի կլոնավորման տեղամասում (MCS1) BamHI և HindIII տրոհման տեղամասերով:embM և embMopt գեները (կոդոնով օպտիմիզացված) ենթակլոնավորվել են MCS1 pCDFDuet-1 (SmR) մեջ BamHI-ի և HindIII-ի հետ և տեղադրվել pCDFDuet-1 (SmR) և pRSFDuet-1 (KanR) (MCS2) երկրորդ բազմակի կլոնավորման վայրում: NdeI/ChoI.EmbAM ձայներիզը ենթակլոնավորվել է pCDFDuet1 (SmR) մեջ BamHI և HindIII ճեղքման տեղամասերով:Orf3/embI գենը (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) կառուցվել է համընկնման ընդլայնման PCR միջոցով՝ օգտագործելով պրայմերներ EmbI_OE_F_NdeI և EmbI_OE_R_XhoI, մարսվել են NdeI-ի և Dliget-ի միջոցով NdeI/Dliget-MchoI-ի միջոցով նույն սահմանափակող ֆերմենտները (Լրացուցիչ սեղան):6).Սահմանափակող ֆերմենտի մարսումը և կապումը կատարվել է արտադրողի արձանագրության համաձայն (New England Biolabs):
Հրապարակման ժամանակը՝ Մար-14-2023